新的β－肌动蛋白和ＲＰＳ２１启动子及其应用制造技术

本发明专利技术涉及新的β－肌动蛋白和核糖体蛋白Ｓ２１（ｒｐＳ２１）启动子的分离及应用。特别地，本发明专利技术的特征为包括仓鼠、大鼠和小鼠的啮齿动物β－肌动蛋白启动子和仓鼠ｒｐＳ２１启动子的序列。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及调节基因元件，如启动子及其应用，例如，在表达蛋白中的应用。更特 别地，本专利技术涉及β-肌动蛋白和核糖体蛋白S21基因的启动子。
技术介绍
每种真核基因含有驱动该基因转录的调节元件。该调节元件包括典型地直接位于 该基因编码区上游的启动子。作为转录机制的一部分，启动子通过提供转录因子的结合位 点来调节转录。启动子通常被用于在细胞培养中和体内表达蛋白质。很多启动子是已知的 并被用于各种表达系统中表达蛋白质。启动子的例子包括巨细胞病毒(CMV)立即早期启动 子、劳氏肉瘤病毒基因组大基因组长末端重复(RSV)、猿病毒40(SV40)启动子、干扰素基因 启动子、金属硫因启动子、和胸腺嘧啶激酶启动子及其它，如Fernandez等人(1999)在Gene ExpressionSystem, Academic Press中所描述的。然而，在本领仍需要提供一种可以产生 高表达水平和/或在长时间内维持表达的启动子。肌动蛋白是一种结构蛋白，其通常在从原核到真核，包括人的所有物种中表 达。先前描述了人和鸡的β-肌动蛋白启动子。一般而言，β-肌动蛋白启动子表现出比 广泛被应用的CMV启动子更普遍的活性(Xu等(2001)Gene 272:149-156)。仅仅当其被连 接到CMV增强子序列时，鸡的β-肌动蛋白启动子比病毒CMV和SV40启动子具有更高的 活性(Xu 等，supra)。核糖体蛋白S21(rpS21)与核糖体40S亚单位有关。人的rpS21基因的启动子已 被鉴别(GenBank 接收号No. AJ250907)。与大多数核糖体启动子基因相似，其缺少传统 的转录元件，如 TATA 盒和 CAAT 序歹Ij (Smirnova 等(2000) Bioorg. Khim. 26 (5) :392_396)。
技术实现思路
本专利技术提供了一种新的肌动蛋白启动子，其与前述公知的肌动蛋白启动 子相比具有低水平的序列同源性(如，人或鸡)。本专利技术还提供了新的rpS21启动子，其与 前述公知的rpS21启动子相比具有低水平的序列同源性(如，人或小鼠)。本专利技术部分基于对中国仓鼠卵巢细胞(CHO)系来源的β-肌动蛋白和rpS21启动 子的发现和分离。本专利技术进一步部分基于仓鼠肌动蛋白启动子比CMV启动子具有显著 的高活性的观察。本专利技术进一步部分基于当被用于表达一定基因时，rpS21启动子至少具 有与仓鼠肌动蛋白启动子相同的活性的观察。本专利技术提供了这些启动子的核酸序列，并包括具有启动子活性的各种核酸序列的变种。在一些实施例中，本专利技术的肌动蛋白 启动子来源于啮齿类，如仓鼠、大鼠和小鼠。典型地rpS21启动子来源于仓鼠。本专利技术进一步提供了含有可操作地连接到异源核酸上的本专利技术的肌动蛋白 或rpS21启动子的载体。在某些实施例中，本专利技术的载体包括可操作地连接到异源核酸上 的启动子，该异源核酸编码异源表达产物，如治疗蛋白质或其片段。在示例性实施例中，表 达产物是酸性鞘磷脂酶(ASM)、α-葡萄糖苷酶(GAA)、或组织血浆酶原激活剂(tPA)。本专利技术还提供了用本专利技术的载体转染的宿主细胞。在描述性实施例中，宿主细胞 是哺乳动物细胞，如CHO、HEK和BHK。本专利技术还提供了用于产生蛋白质的方法。产生蛋白质的方法包括，例如，培养转染 细胞，该细胞用含有可操作地连接到编码蛋白质的异源核酸上的本专利技术的β-肌动蛋白启 动子和/或rpS21启动子的载体转染的细胞，以及回收蛋白质。在一些实施例中，异源表达 产物是分泌蛋白，其从培养基中被回收。在描述性实施例中，蛋白质是六511、6六六、或1 八。本专利技术还涉及1. 一种选自SEQ ID NOs :1、2、3的核苷酸序列的分离的啮齿动物β -肌动蛋白启 动子或其具有启动子活性的变种。2. 一种SEQ ID NO=I中列出的分离的仓鼠β _肌动蛋白启动子核苷酸序列，或其 具有启动子活性的变种。3. 一种SEQ ID NO :2中列出的分离的大鼠β -肌动蛋白启动子核苷酸序列，或其 具有启动子活性的变种。4. 一种SEQ ID NO :3中列出的分离的小鼠β -肌动蛋白启动子核苷酸序列，或其 具有启动子活性的变种。5. 一个包括SEQ ID NO 1中列出的核苷酸序列的分离的核酸，或其具有启动子活 性的变种。6. 一个包括SEQ ID NO 2中列出的核苷酸序列的分离的核酸，或其具有启动子活 性的变种。7. 一个载体，其包括SEQ ID NO 1中的启动子，或其具有启动子活性的变种。8. 一个载体，其包括SEQ ID NO 2中的启动子，或其具有启动子活性的变种。9. 一个载体，其包括SEQ ID NO 3中的启动子，或其具有启动子活性的变种。10.根据权利要求7-9的任何一项所述的载体，其中启动子被可操作地连接到异 源核酸上。11.根据权利要求10所述的载体，其中异源核酸编码治疗性蛋白。12.根据权利要求11所述的载体，其中治疗性蛋白选自酸性鞘磷脂酶、α -葡萄糖 苷酶或组织血浆酶原激活剂。13.用权利要求7-12的任何一项的所述的载体转染的宿主细胞。14.根据权利要求13的宿主细胞，其中细胞是CHO细胞。15. 一种生产蛋白质的方法，其包括(a)培养用含有仓鼠肌动蛋白启动子或其变种的载体转染的细胞，该启动子 或其变种被可操作地连接到编码该蛋白质的核酸上，和；(b)回收蛋白质。16.根据权利要求15所述的方法，其中蛋白质是抗体。17.根据权利要求16所述的方法，其中抗体结合TGF-β族成员。18.根据权利要求15所述的方法，其中蛋白质是治疗性蛋白。19.根据权利要求18所述的方法，其中治疗性蛋白选自酸性鞘磷脂酶、α-葡萄糖 苷酶或组织血浆酶原激活剂。20.含有权利要求1-6的任何一项所述的启动子的转基因动物。 根据权利要求20所述的转基因动物，其中动物是哺乳动物。 具有SEQ ID NO :39的核苷酸序列的分离的rpS21启动子，或其具有启动子活21.22.性的变种。 上。脂酶。23.含有SEQIDNO :39的核苷酸序列或其具有启动子活性的变种的载体。24.根据权利要求23所述的载体，其中核苷酸序列被可操作地连接到异源核酸25.根据权利要求24所述的载体，其中异源核酸编码治疗性蛋白。26.根据权利要求25所述的载体，其中治疗性蛋白是α-葡萄糖苷酶或酸性鞘磷27.用权利要求23-26的任何一项所述的载体转染的宿主细胞。28.根据权利要求27所述的宿主细胞，其中细胞是CHO细胞。29.—种生产蛋白的方法，其包括(a)培养用含有仓鼠rpS21启动子或其变种的载体转染的细胞，该启动子或其变 种被可操作地连接到该编码蛋白质的核酸上，和； 回收蛋白质。根据权利要求29所述的方法，其中蛋白是抗体。 根据权利要求29所述的方法，其中蛋白是治疗性蛋白。 根据权利要求31所述的方法，其中治疗性蛋白是α -葡萄糖苷酶或酸性鞘磷一种含有权利要求22所述的启动子的转基因动物。 根据权利要求33所述的转基因动物，其中动物是哺乳动物。 一种分离的β “肌动蛋白启动子，其核苷酸序列作为ATCC参考号ΡΤΑ-5309 被保藏，其分类命名为含有克隆到噬菌粒载体PBluescript II KS+的β-肌动蛋白启 动子的仓鼠基因组克隆pBlu本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种选自ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯｓ：１、２、３的核苷酸序列的分离的啮齿动物β－肌动蛋白启动子或其具有启动子活性的变种。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：SD埃斯蒂斯，W张，
申请(专利权)人：建新公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]