苏氨酸脱水酶突变体制造技术

本发明专利技术涉及微生物技术领域，具体涉及苏氨酸脱水酶突变体

【技术实现步骤摘要】
苏氨酸脱水酶突变体、产支链氨基酸的重组微生物及其应用


[0001]本专利技术涉及微生物
，具体涉及苏氨酸脱水酶突变体
、
产支链氨基酸的重组微生物及其应用
。

技术介绍

[0002]支链氨基酸
(branch chain amino acid
，
BCAA)
包括缬氨酸
、
亮氨酸和异亮氨酸，是人体的必需氨基酸，在人体内具有重要的生理功能，广泛应用于食品
、
药品
、
保健品
、
化妆品
、
饲料等领域，可作为人体营养增强剂
、
动物饲料添加剂
、
医疗产品成分和化妆品成分等
。
目前，支链氨基酸主要通过微生物发酵生产，大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌是主要的生产菌株
。
但是，大肠杆菌通常会合成内毒素，可能会造成产品污染
。
因此，谷氨酸棒状杆菌成为生产支链氨基酸的理想菌株
。
[0003]以异亮氨酸的合成途径为例，在谷氨酸棒状杆菌中，从
L
‑
天冬氨酸开始，经过十步反应合成异亮氨酸，其中部分合成酶也可用于合成缬氨酸和亮氨酸
。
因此，高产异亮氨酸的菌株不易获得
。
[0004]为了改善菌株的
L
‑
异亮氨酸生产能力，多采取诱变育种的方法，但是该方法得到的菌株传代后易退化
。
例如：专利申请<br/>CN111197014A
公开了通过紫外照射和亚甲基双胍双诱变的方式获得一株
L
‑
异亮氨酸生产菌
(
保藏编号为
CCTCC NO
：
M 2019695)
，但该生产菌在培养过程中需要添加新霉素防止回复突变
。
现有技术中也有利用基因工程理性改造谷氨酸棒状杆菌用于产
L
‑
异亮氨酸的报道
(
例如：专利申请
CN111321100A
公开了一株
L
‑
异亮氨酸生产菌，产酸
32.1g/L
，转化率
18.1
％，发酵周期
70
‑
75h)
，但是转化率仍较低且发酵周期较长，无法满足工业生产的需求
。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的之一是提供苏氨酸脱水酶突变体及其应用
。
本专利技术的另一目的是提供表达苏氨酸脱水酶突变体的重组微生物及其应用
。
[0006]具体地，本专利技术提供以下技术方案：
[0007]本专利技术提供苏氨酸脱水酶突变体，以谷氨酸棒杆菌野生型苏氨酸脱水酶为参考序列，所述苏氨酸脱水酶突变体含有第
54
位由丙氨酸突变为除丙氨酸以外的氨基酸
、
第
131
位由缬氨酸突变为除缬氨酸以外的氨基酸
、
第
171
位由精氨酸突变为除精氨酸以外的氨基酸
、
第
218
位由蛋氨酸突变为除蛋氨酸以外的氨基酸
、
第
243
位由甘氨酸突变为除甘氨酸以外的氨基酸
、
第
381
位由苏氨酸突变为除苏氨酸以外的氨基酸
、
第
383
位由苯丙氨酸突变为除苯丙氨酸以外的氨基酸的突变中的任意一种或至少两种的组合
。
[0008]本专利技术中，苏氨酸脱水酶催化苏氨酸脱水分解生成氨和
α
‑
酮丁酸的反应，该酶受到异亮氨酸的反馈抑制调控
。
谷氨酸棒杆菌中苏氨酸脱水酶由
ilvA
基因编码，野生型谷氨酸棒杆菌的苏氨酸脱水酶的氨基酸序列如
SEQ ID NO.1
所示
。
[0009]本专利技术发现，苏氨酸脱水酶的第
54
位
、
第
131
位
、
第
171
位
、
第
218
位
、
第
243
位
、
第
381
位
、
第
383
位氨基酸的突变能够解除异亮氨酸对该酶的反馈抑制，显著提高在异亮氨酸存在条件下该酶的活性，进而提高异亮氨酸等支链氨基酸的合成能力
。
[0010]优选地，以谷氨酸棒杆菌野生型苏氨酸脱水酶为参考序列，所述苏氨酸脱水酶突变体含有第
54
位由丙氨酸突变为苏氨酸
、
第
131
位由缬氨酸突变为丙氨酸
、
第
171
位由精氨酸突变为组氨酸
、
第
218
位由蛋氨酸突变为异亮氨酸
、
第
243
位由甘氨酸突变为精氨酸
、
第
381
位由苏氨酸突变为丙氨酸
、
第
383
位由苯丙氨酸突变为丙氨酸的突变中的任意一种或至少两种的组合
。
[0011]进一步优选地，所述苏氨酸脱水酶突变体具体如
SEQ ID NO.2
所示的氨基酸序列
。
该突变体对于异亮氨酸反馈抑制接触的效果更优，能够显著提高在高浓度异亮氨酸存在条件下该酶的活性，进而促进异亮氨酸等支链氨基酸的高效合成
。
[0012]本领域技术人员应该理解，在上述苏氨酸脱水酶突变体序列的
N
端或
C
端添加标签蛋白或将其与其他蛋白进行融合形成融合蛋白，在不改变上述苏氨酸脱水酶突变体本身结构的情况下，其活性不会发生明显改变，因此，上述添加标签的蛋白或融合蛋白也在本专利技术的保护范围内
。
[0013]本专利技术还提供编码所述苏氨酸脱水酶突变体的基因
。
[0014]根据上述提供的苏氨酸脱水酶突变体的氨基酸序列，本领域技术人员能够获得其编码基因的序列
。
基于密码子的简并性，编码上述氨基酸序列的基因序列不止一种，所有能够编码上述突变体的基因均在本专利技术的保护范围内
。
[0015]作为本专利技术的一种实施方式，编码苏氨酸脱水酶突变体的基因的核苷酸序列如
SEQ ID NO.3
所示
。
[0016]本专利技术还提供含有所述基因的生物材料，所述生物材料为重组
DNA、
载体或宿主细胞
。
[0017]其中，所述重组
DNA
可为在所述基因的上游或下游连接用于驱动其转录
、
翻译的元件得到的重组
本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
苏氨酸脱水酶突变体，其特征在于，以谷氨酸棒杆菌野生型苏氨酸脱水酶为参考序列，所述苏氨酸脱水酶突变体含有第
54
位由丙氨酸突变为除丙氨酸以外的氨基酸
、
第
131
位由缬氨酸突变为除缬氨酸以外的氨基酸
、
第
171
位由精氨酸突变为除精氨酸以外的氨基酸
、
第
218
位由蛋氨酸突变为除蛋氨酸以外的氨基酸
、
第
243
位由甘氨酸突变为除甘氨酸以外的氨基酸
、
第
381
位由苏氨酸突变为除苏氨酸以外的氨基酸
、
第
383
位由苯丙氨酸突变为除苯丙氨酸以外的氨基酸的突变中的任意一种或至少两种的组合
。2.
根据权利要求1所述的苏氨酸脱水酶突变体，以谷氨酸棒杆菌野生型苏氨酸脱水酶为参考序列，所述苏氨酸脱水酶突变体含有第
54
位由丙氨酸突变为苏氨酸
、
第
131
位由缬氨酸突变为丙氨酸
、
第
171
位由精氨酸突变为组氨酸
、
第
218
位由蛋氨酸突变为异亮氨酸
、
第
243
位由甘氨酸突变为精氨酸
、
第
381
位由苏氨酸突变为丙氨酸
、
第
383
位由苯丙氨酸突变为丙氨酸的突变中的任意一种或至少两种的组合；优选地，所述苏氨酸脱水酶突变体具体如
SEQ ID NO.2
所示的氨基酸序列
。3.
编码权利要求1或2所述的苏氨酸脱水酶突变体的基因
。4.
含有权利要求3所述的基因的生物材料，其特征在于，所述生物材料为重组
DNA、
载体或宿主细胞
。5.
一种重组微生物，其特征在于，其表达权利要求1或2所述的苏氨酸脱水酶突变体
。6.
根据权利要求5所述的重组微生物，其特征在于，所述苏氨酸脱水酶突变体的编码基因上游可操作性地连接优化的
ilvA
启动子，所述优化的
i...

【专利技术属性】
技术研发人员：张晓云，吴涛，栾明月，薛婷莉，李鑫磊，李岩，赵津津，
申请(专利权)人：胡丹，
类型：发明
国别省市：