一种靶向制造技术

本发明专利技术公开了一种靶向

【技术实现步骤摘要】
一种靶向H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白的纳米抗体


[0001]本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种靶向
H5
亚型禽流感病毒血凝素蛋白的纳米抗体
。

技术介绍

[0002]禽流感
(avian influenza
，
AI)
是由禽流感病毒
(avian influenza virus
，
AIV)
引起的一种禽类烈性综合征，属于正黏病毒科流感病毒属，分为
A、B、C
三型，存在感染人类的风险，对动物而言轻则使产蛋率下降造成巨大经济损失，重则使动物感染致死，严重影响养禽业发展
。
接种疫苗一直是控制禽流感病毒传播最有效的手段
。
禽流感病毒的基因组由8个负链单股
RNA
片段组成，血凝素
(hemagglutinin,HA)
和神经氨酸酶
(neuraminidase,NA)
是其最主要的外膜蛋白，依据二者的抗原性不同，可将
AIV
分成
16
种
HA
亚型及9种
NA
亚型
。
近几年，禽流感发生的特点为：病毒毒株相对单一；发病的严重程度与家禽种类有关；不同品种有差异，地方品种比白羽肉鸡等常见进口品种易感度低；不同日龄家禽有差异，青年禽抵抗力低于老龄禽；群体健康状况越差则发病损失越大，发病反应程度越重；受应激刺激影响的家禽反应强于未受应激的；继发感染的家禽损失大于单独感染禽流感的家禽，早发现并早控制继发感染可有效降低禽流感发病产生的损失：受新城疫抗体水平高低影响，新城疫抗体水平较低的鸡群，发生禽流感时造成的损失比新城疫抗体水平高的鸡群大
。
[0003]纳米抗体
(Nanobody
，
Nb)
是一种新型基因工程抗体，因其分子量小
、
稳定性强
、
亲和力高
、
能识别隐蔽表位
、
组织穿透力强
、
易于制备
、
成本低廉且便于进行改造与修饰，是疾病诊断
、
治疗和研究的理想分子，在癌症
、
脑部神经性疾病
、
毒素中毒性疾病
、
艾滋病以及其它感染性疾病和蛋白质功能
、
晶体结构解析等领域已有大量的相关研究报道
。
骆驼科动物或鲨鱼科动物体内含有天然缺失轻链的重链抗体亚型，通过基因工程手段制备的可变区重链抗体
(VHH)
即为纳米抗体
。
在动物疫病上，各国学者以全病原
、
病毒结构蛋白
、
非结构蛋白和病毒相关复制酶等为靶标，通过噬菌体展示技术
、
酵母杂交和细菌展示技术筛选了多种病原的
Nb
，推动了动物疫病防控技术的发展
。Nb
由于分子量小
、
具有较长的
CDR3
区，可很好识别一些隐蔽表位，是开发广谱中和治疗制剂的理想分子
。
同时，
Nb
能耐受胃蛋白酶
、
糜蛋白酶和极端理化条件，使其可以通过雾化吸入或口服方式大剂量给药，适用于畜禽大规模给药，在治疗呼吸道和消化道疫病上潜力巨大
。
[0004]噬菌体展示技术
(phage display)
是一种用于鉴定蛋白质和其他大分子配体的体外筛选技术
。
它将外源编码多肽或蛋白质的基因通过基因工程技术插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，在阅读框能正确表达，使外源多肽或蛋白在噬菌体的衣壳蛋白上形成融合蛋白，随子代噬菌体的重新组装呈现在噬菌体表面，可以保持相对的空间结构和生物活性
。
然后利用靶分子，采用合适的淘洗方法，洗去未特异性结合的噬菌体
。
再用酸碱或者竞争的分子洗脱下结合的噬菌体，中和后的噬菌体感染大肠杆菌扩增，经过3‑5轮的富集，逐步提高可以特异性识别靶分子的噬菌体比例，最终获得识别靶分子的多肽或者蛋白
。
通过噬菌体展示快速分离特定配体在许多应用中是有利的，包括选择酶的活性和变构位点
ID NO.3
所示的核酸分子编码相同蛋白的核苷酸序列；或
[0027]c)
与
SEQ ID NO.3
具有
80
％
、85
％或
90
％以上的同源性，且与
SEQ ID NO.3
所示的核酸分子编码相同蛋白的核苷酸序列
。
[0028]优选地，所述用于编码本专利技术第二方面所述融合蛋白的核酸片段的核苷酸序列为：
[0029]a)
如
SEQ ID NO.9
所示的核苷酸序列；或
[0030]b)
将
SEQ ID NO.9
经过一个或几个核苷酸的取代和
/
或缺失和
/
或添加，且与
SEQ ID NO.3
所示的核酸分子编码相同蛋白的核苷酸序列；或
[0031]c)
与
SEQ ID NO.9
具有
80
％
、85
％或
90
％以上的同源性，且与
SEQ ID NO.3
所示的核酸分子编码相同蛋白的核苷酸序列
。
[0032]在本专利技术的第四个方面，提供一种表达载体，所述表达载体包含本专利技术第三方面所述核酸分子
。
[0033]在本专利技术的一些实施方式中，所述表达载体具体为将本专利技术第三方面所述核酸分子克隆进入载体得到
。
[0034]优选地，所述载体包括病毒性载体或非病毒性载体
。
[0035]优选地，所述病毒性载体包括慢病毒载体
、
腺病毒载体
、
杆状病毒载体
、
反转录病毒载体
、
痘病毒载体
、
仙台病毒载体
、
单纯疱疹病毒载体中的至少一种
。
[0036]优选地，所述非病毒性载体包括：质粒载体
、
阳离子多聚物载体
、
壳聚糖
、
聚乙烯亚胺
、
纳米颗粒载体
、
脂质体中的至少一种
。
[0037]优选地，所述质粒载体为
PET
系列载体
。
[0038]在本专利技术的一些优选实施方式中，所述载体为
pET
‑
9a、pET
‑
28a(+)、pET
‑
22b(+)、pET
‑
26b(+)...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种
H5
亚型禽流感病毒血凝素蛋白的纳米抗体或其抗原结合片段，包含重链可变区，所述重链可变区包含
CDR1、CDR2、CDR3
，其中，
CDR1、CDR2、CDR3
的氨基酸序列分别如
SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7
所示
。2.
根据权利要求1所述的纳米抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述纳米抗体为：
a)
如
SEQ ID NO.4
所示的氨基酸序列；或
b)
将
SEQ ID NO.4
经过一个或几个氨基酸的取代和
/
或缺失和
/
或添加，且与
SEQID NO.4
所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或
c)
与
SEQ ID NO.4
具有
80
％
、85
％或
90
％以上的同源性，且
SEQ ID NO.4
所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列
。3.
一种融合蛋白，包含权利要求1或2所述的纳米抗体或其抗原结合片段；优选地，所述融合蛋白还包括信号肽
、
引导肽
、
靶向肽
、
标签肽
、
荧光蛋白中的至少一种；优选地，所述标签肽包括麦芽糖结合蛋白
。4.
一种核酸分子，所述核酸分子包含以下成分：
a)
用于编码权利要求1或2所述纳米抗体或其抗原结合片段的核酸片段；或
b)
用于编码权利要求3所述融合蛋白的核酸片段
。5.
根据权利要求4所述的核酸分子，其特征在于，所述用于编码权利要求1或2所述纳米抗体或其抗原结合片段的核酸片段为：
a)
如
SEQ ID NO.3
所示的核苷酸序列；或
b)
将
SEQ ID NO.3
经过一个或几个核苷酸的取代和
/
或缺失和
/
或添加，且与
SEQ ID NO.3
所示的核酸分子编码相同蛋白的核苷酸序列；或
...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘宇彤，许斯祺，冯赛祥，龚喜悦，王珂，罗行晓，张沁莹，丁千越，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：