一种制造技术

本发明专利技术公开了一种

【技术实现步骤摘要】
一种L
‑
天冬氨酸
‑
β
‑
脱羧酶突变体及其在制备L
‑
丙氨酸中的应用
(一)

[0001]本专利技术属于生物催化领域，涉及一种
L
‑
天冬氨酸
‑
β
‑
脱羧酶突变体
AjASD
‑
T175S
及其催化
L
‑
天冬氨酸合成
L
‑
丙氨酸中的应用
。
(二)
技术介绍

[0002]L
‑
丙氨酸又叫2‑
氨基丙酸，在自然界中广泛存在，属于氨基酸类有机化合物，其衍生物在日化
、
工业
、
食品添加剂等领域用途广阔
。
在日化方面，
L
‑
丙氨酸作为氨基酸表面活性剂的原料，具有高度的生物亲和性
、
毒性低并且使用广泛
。
在食品及添加剂方面，因
L
‑
丙氨酸具有甜味，可对食品进行提鲜并减少食品本身的苦涩，尤其具有更高的安全性，能够参与体内的氨基代谢循环，因此被国内外广泛应用于食品的调味
。
郭媛等人探究了
L
‑
丙氨酸在食品工业中的各类应用，可添加到酱油
、
鱼露
、
鸡精以及腌制品等食品中进行增味和降低腥涩
。
在工业上，
L
‑
丙氨酸是合成依那普利等的重要原料，在医药等领域是不可或缺的一份子，并且它可为转氨酶提供氨基供体
,
在临床上常添加到输液中
。
因此，
L
‑
丙氨酸的应用十分广泛，与人民的生活息息相关
。
[0003]目前，合成
L
‑
丙氨酸的方法主要有蛋白质水解法
、
化学合成法以及生物法，生物法又细分为发酵法和酶促法
。
蛋白质水解法是通过酶解或者酸解丝绢
、
明胶和蛋白质含量高的玉米等含有大量
L
‑
丙氨酸的物质的一类方法，由于产物需进行手性拆分等工序，工作量大且成本较高，不适合工业化应用
。
在化学合成法中，丙酸氯化法是其中一种最为常见的化学合成法之一，丙酸氯化法中最重要的两个原料即为丙酸和氨水
。
该法成本高
、
收率低
、
产品质量差且容易造成环境污染，而今在工业上基本被舍弃
。
发酵法属于生物合成法中的一种，在合成
L
‑
丙氨酸的应用上，相较于水解法和化学法来说是卓有成效的，是目前生产
L
‑
丙氨酸的主要方法
。
生物催化法是另一种生物合成法，主要是以酶作为催化剂，对底物进行催化从而生成所需产物
。
这种方法相对于生物发酵法来说，具有体系简单
、
条件温和以及副产物少等优点，越来越受到关注
。
目前生物催化法所开发的酶活力还不够高，不足以与发酵法竞争，因而有必要开发更具竞争力的高活力生物催化剂
。
(三)
技术实现思路

[0004]本专利技术目的是提供一种
L
‑
天冬氨酸
‑
β
‑
脱羧酶突变体及其催化
L
‑
天冬氨酸生成
L
‑
丙氨酸中的应用，本专利技术选取源自琼氏不动杆菌
(Acinetobacter junii)
的
L
‑
天冬氨酸
‑
β
‑
脱羧酶
AjASD
作为研究对象，通过同源建模
、
分子对接以及引入突变，成功获得突变体
AjASD
‑
T175S。L
‑
天冬氨酸
‑
β
‑
脱羧酶
AjASD
对
L
‑
天冬氨酸的催化活力低，转化
500mM
底物合成
L
‑
丙氨酸的得率仅为
68.47
％，而改造获得的
L
‑
天冬氨酸
‑
β
‑
脱羧酶突变体
AjASD
‑
T175S
在催化
L
‑
天冬氨酸脱羧生成
L
‑
丙氨酸反应中，
L
‑
丙氨酸的得率可达
97.44
％，得率提高了
42.31
％
。
[0005]本专利技术采用的技术方案是：
[0006]本专利技术提供一种
L
‑
天冬氨酸
‑
β
‑
脱羧酶突变体
(
记为
AjASD
‑
T175S)
，所述
L
‑
天冬氨酸
‑
β
‑
脱羧酶突变体
AjASD
‑
T175S
是将
SEQ ID NO.1
所示氨基酸序列中第
175
位苏氨酸突变为丝氨酸获得的
。
所述
L
‑
天冬氨酸
‑
β
‑
脱羧酶突变体
AjASD
‑
T175S
的氨基酸序列为
SEQ ID NO.4
所示
。
[0007]本专利技术还提供一种所述
L
‑
天冬氨酸
‑
β
‑
脱羧酶突变体
AjASD
‑
T175S
编码基因，所述编码基因的核苷酸序列为
SEQ ID NO.5
所示
。
[0008]本专利技术还涉及一种含所述
L
‑
天冬氨酸
‑
β
‑
脱羧酶突变体
AjASD
‑
T175S
编码基因的重组载体及所述载体构建的基因工程菌
。
所述重组载体以
pET28a
为基础载体，所述基因工程菌以
E.coli BL21(DE3)
为宿主菌
。
[0009]所述基因工程菌由如下方法得到：将
L
‑
天冬氨酸
‑
β
‑
脱羧酶
AjASD
基因
(
核苷酸序列如
SEQ ID NO.2
所示...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种
L
‑
天冬氨酸
‑
β
‑
脱羧酶突变体，其特征在于，所述
L
‑
天冬氨酸
‑
β
‑
脱羧酶突变体是将
SEQ ID NO.1
所示氨基酸序列中第
175
位苏氨酸突变为丝氨酸获得的
。2.
一种权利要求1所述
L
‑
天冬氨酸
‑
β
‑
脱羧酶突变体的编码基因
。3.
一种含权利要求2所述
L
‑
天冬氨酸
‑
β
‑
脱羧酶突变体编码基因的重组载体
。4.
一种由权利要求3所述重组载体构建的基因工程菌
。5.
一种权利要求1所述
L
‑
天冬氨酸
‑
β
‑
脱羧酶突变体在催化
L
‑
天冬氨酸制备
L
‑
丙氨酸中的应用
。6.
如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述应用为：将含
L
‑
天冬氨酸
‑
β
‑
脱羧酶突变体编码基因的工程菌经诱导表达获得的湿菌体作为催化剂，以
L
‑
天冬氨酸为底物，以5’‑
磷酸吡哆醛为辅酶，以
pH 4
‑9的缓冲液为反应介质构成反应体系，在
30
‑
50℃、100
‑
300rpm
条件下反应，获得含
L
‑

【专利技术属性】
技术研发人员：唐裔，刘训，李霞，魏春，杨杜霞，应向贤，章银军，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：