靶向敲除牛乳腺上皮细胞制造技术

本发明专利技术提供了一种靶向敲除牛乳腺上皮细胞

【技术实现步骤摘要】
靶向敲除牛乳腺上皮细胞TARDBP基因的sgRNA及其构建的细胞株


[0001]本专利技术属于基因工程
，尤其涉及一种靶向牛乳腺上皮细胞
TARDBP
基因的
sgRNA
及其构建的细胞株
。

技术介绍

[0002]本部分的陈述仅仅是提供了与本专利技术相关的
技术介绍
信息，不必然构成在先技术
。
[0003]TARDBP
基因，又称为
TDP
‑
43
基因，位于牛
16
号染色体，编码
TAR DNA
‑
binding protein 43(TDP
‑
43)
蛋白，是一种
DNA
和
RNA
结合蛋白，具有转录调控
、
转录后调控等多种功能
。
小鼠上的研究发现，敲除
TARDBP
基因引起大的乳脂滴聚集和严重的乳脂分泌缺陷，最终导致泌乳失败
。
机制研究发现
TDP
‑
43
蛋白通过转录后调控乳脂分泌相关基因
Btn1a1
和
Xdh
的
mRNA
稳定性影响乳脂的分泌
。
在人上的研究发现，
TARDBP
的表达水平与更高的产奶量呈正相关
。
但是，
TARDBP
基因在奶牛的乳脂分泌和产奶性能方面的功能及其机制仍有待进一步研究
。
[0004]目前，细胞水平研究牛基因功能一般采用
siRNA
干扰技术进行基因沉默，但是该技术存在干扰效率低的问题
。
建立敲除或缺失牛
TARDBP
基因的乳腺上皮细胞株，可为研究该基因的功能和及其机制提供稳定的细胞模型，为揭示调控奶牛乳脂分泌和产能性能的分子机制奠定基础
。
[0005]CRISPR/Cas9
基因编辑技术作为第三代基因编辑技术，相对于前两代基因编辑技术具有构建系统简单
、
精准度高
、
成本低
、
并且能同时对多个位点进行定点编辑等优势，已成为目前主流的基因编辑技术
。
但是该系统至今还存在一些问题，如，编辑效率受靶点
(sgRNA)
影响较大，在不同的物种中编辑效率差异显著，另外，在不同的细胞中递送效率也不同，编辑效率还会受到递送方式的影响，总之，影响因素众多，编辑效率完全不可预期
。
[0006]虽然，
CRISPR/Cas9
技术也有研究将其用于牛细胞，但是并未有研究证明
CRISPR/Cas9
技术能否敲除牛乳腺上皮细胞
TARDBP
基因，以及
TARDBP
基因在奶牛的乳脂分泌和产奶方面的功能及其机制
。

技术实现思路

[0007]为克服上述现有技术的不足，本专利技术的第一目的在于提供了一种用于靶向牛乳腺上皮细胞
TARDBP
基因的
sgRNA
；本专利技术的第二目的在于提供一种用于靶向牛乳腺上皮细胞
TARDBP
基因的
sgRNA
表达载体；本专利技术的第三目的在于提供一种用于敲除牛乳腺上皮细胞
TARDBP
基因的试剂盒；本专利技术的第四目的在于提供一种
CRISPR/Cas9
系统；本专利技术的第五目的在于提供一种用于构建牛乳腺上皮细胞
TARDBP
基因细胞株的试剂盒；本专利技术的第六目的在于提供一种牛乳腺上皮细胞
TARDBP
基因敲除细胞株的构建方法；本专利技术的第七目的在于提供一种牛乳腺上皮细胞
TARDBP
基因敲除的细胞株
。
[0008]为实现上述目的，本专利技术的一个或多个实施例提供了如下技术方案：
[0009]第一方面，本专利技术提供一种用于靶向敲除牛乳腺上皮细胞
TARDBP
基因的
sgRNA
，
[0010]包括
sgRNA1
或
sgRNA2
；
[0011]所述
sgRNA1
的核苷酸序列如下：
GAGATACCATCGGAAGACGA(SEQ ID NO.1)
[0012]所述
sgRNA2
的核苷酸序列如下：
GTCTTCCGATGGTATCTCAA(SEQ ID NO.2)。
[0013]上述
sgRNA
是利用在线工具
E
‑
Crisp
设计，并经过筛选后获得，所述
sgRNA
能够精确指导
Cas9
蛋白靶向切割
TARDBP
基因
。
[0014]第二方面，本专利技术提供一种用于靶向敲除牛乳腺上皮细胞
TARDBP
基因的
sgRNA
表达载体，其特征在于，所述载体包括第一方面所述的
sgRNA1
或
sgRNA2
的
DNA
序列
。
[0015]优选地，将包含
sgRNA1
的引物退火获得双链
DNA
片段1，通过
DNA
连接酶将
DNA
片段1连接到表达质粒上获得；
[0016]或，将包含
sgRNA2
的引物退火获得双链
DNA
片段2，通过
DNA
连接酶将
DNA
片段2连接到表达质粒上获得；
[0017]优选地，所述表达质粒为
Genloci pGK1.1(Puro
r
)。
[0018]优选地，
sgRNA
的引物包括，
sgRNA1
‑
F
：
caccGAGATACCATCGGAAGACGA(SEQ ID NO.3)
；
[0019]sgRNA1
‑
R
：
aaacTCGTCTTCCGATGGTATCTC(SEQ ID NO.4)
；
[0020]或，
sgRNA2
‑
F
：
caccGTCTTCCGATGGTATCTCAA(SEQ ID NO.5)
；
[0021]sgRNA2
‑
R
：
aaacTTGAGATACCATCGGAAGAC(SEQ ID NO.6)。
[0022]第三方面，本专利技术提供一种用于敲除牛乳腺上皮细胞
TARDBP
基因的试剂盒，包括第二方面所述本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种用于靶向敲除牛乳腺上皮细胞
TARDBP
基因的
sgRNA
，其特征在于，包括
sgRNA1
或
sgRNA2
；所述
sgRNA1
的核苷酸序列如下：
GAGATACCATCGGAAGACGA(SEQ ID NO.1)
所述
sgRNA2
的核苷酸序列如下：
GTCTTCCGATGGTATCTCAA SEQ ID NO.2)。2.
一种用于靶向敲除牛乳腺上皮细胞
TARDBP
基因的
sgRNA
表达载体，其特征在于，所述载体包括权利要求1中所述的
sgRNA1
或
sgRNA2
的
DNA
序列
。3.
如权利要求2所述表达载体的构建方法，其特征在于，将包含
sgRNA1
的引物退火获得双链
DNA
片段1，通过
DNA
连接酶将
DNA
片段1连接到表达质粒上获得；或，将包含
sgRNA2
的引物退火获得双链
DNA
片段2，通过
DNA
连接酶将
DNA
片段2连接到表达质粒上获得；优选的，所述表达质粒为
Genloci pGK1.1(Puro
r
)。4.
如权利要求3所述表达载体的构建方法，其特征在于，
sgRNA
的引物包括，
sgRNA1
‑
F
：
caccGAGATACCATCGGAAGACGA(SEQ ID NO.3)
；
sgRNA1
‑
R
：
aaacTCGTCTTCCGATGGTATCTC(SEQ ID NO.4)
；
sgRNA2
‑
F
：
caccGTCTTCCGATGGTATCTCAA(SEQ ID NO.5)
；
sgRNA2
‑
R
：
aa...

【专利技术属性】
技术研发人员：张亚冉，张清兰，高亚平，王秀革，肖遥，魏晓超，鞠志花，杨春红，姜强，王金鹏，刘文浩，黄金明，
申请(专利权)人：山东省农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：