靶向制造技术

本发明专利技术涉及靶向

【技术实现步骤摘要】
靶向SIRP
α
和PD
‑
L1的双特异性抗体或其抗原结合片段及应用


[0001]本专利技术涉及生物医药
，具体涉及靶向
SIRP
α
和
PD
‑
L1
的双特异性抗体或其抗原结合片段及应用
。

技术介绍

[0002]PD
‑
1(CD279)
最早于
1992
年被报道，人
PD
‑1编码基因
PDCD1
位于
2q37.3
，全长
2097bp
，由 6
个外显子组成
。PD
‑1是膜蛋白，属于
CD28
免疫球蛋白超家族，主要表达在激活后的
T
细胞表面，此外还在胸腺的
CD4
‑
CD8
‑
T
细胞
、
活化的
NK
细胞和单核细胞有低丰度表达
。PD
‑1有2个配体，分别是
B7
蛋白家族的
PD
‑
L1(CD274,B7
‑
H1)
和
PD
‑
L2(CD273,B7
‑
DC)
，
PD
‑
L1
和
PD
‑
L2
氨基酸序列有
40
％相同
。
两者区别主要在于表达模式不同，
PD
‑
L1
组成性的低表达于
APCs、
非造血细胞
(
如血管内皮细胞
、
胰岛细胞
)
和免疫豁免部位
(
如胎盘
、
睾丸和眼睛
)
，炎性细胞因子如
I
型和
II
型干扰素
、TNF
‑
α
和
VEGF
等均可以诱导
PD
‑
L1
的表达
。PD
‑
L2
则只在被激活的巨噬细胞和树突细胞中有表达
。PD
‑1与
PD
‑
L1
在激活的
T
细胞结合后，
PD
‑1的
ITSM
基序发生酪氨酸磷酸化，进而导致下游蛋白激酶
Syk
和
PI3K
的去磷酸化，抑制下游
AKT、ERK
等通路的活化，最终抑制
T
细胞活化所需基因及细胞因子的转录和翻译，发挥负向调控
T
细胞活性的作用
。
在肿瘤细胞中，肿瘤细胞及肿瘤微环境通过上调
PD
‑
L1
表达并与肿瘤特异的
CD8+T
细胞表面的
PD
‑1结合，负调控
T
细胞活性，抑制免疫反应
。
有越来越多的证据表明肿瘤利用
PD
‑1依赖的免疫抑制免疫逃避
。
在各种实体瘤和血液系统恶性肿瘤种均已经发现
PD
‑
L1
和
PD
‑
L2
的高表达
。
此外，
PD
‑
Ls
的表达与肿瘤细胞的不良预后之间具有很强相关性
。
[0003]肿瘤微环境中的肿瘤相关巨噬细胞
(TAM
，
tumor associated macrophage)
的吞噬作用受到抑制，其原因在于几乎所有肿瘤细胞表面都高表达
CD47
蛋白，能够与骨髓细胞表面的信号调节蛋白
α
(signalregulatory protein
α
,SIRP
α
)
结合向机体发出“don
’
t eat me”或“self”的信号，从而抑制吞噬作用
。CD47
又名整合素相关蛋白
(IAP
，
intergin
‑
associated protein)
，是一种广泛表达的跨膜糖蛋白，属于免疫球蛋白
(Ig)
超家族
。CD47
分子量为
50kD
，结构包含了大量的糖基化的
N
‑
末端
IgV
可变结构域，5个高度疏水的跨膜结构域和一个短的
C
‑
末端胞质尾区，
C
‑
末端胞质尾区的4种选择性拼接形式决定了
CD47 在不同组织的表达
。
与之相对应的
SIRP
α
又被称为
SHPS
‑
1、BIT
或
CD172a
蛋白，它是一种跨膜蛋白，主要在骨髓细胞
(myeloid cell)
上表达，包括巨噬细胞
、
骨髓树突状细胞
、
粒细胞
、
肥大细胞及其前体细胞
。SIRP
α
由胞外的3个
Ig
样结构域和胞质内的4个酪氨酸残基组成，该4个酪氨酸残基被推测认为是磷酸化位点
。
当发生磷酸化后，
SIRP
α
通过结合
SHP
‑
1/2
蛋白的
SH2
结构域并使之激活，从而激活下游信号通路
。SHP
‑1和
SHP
‑2蛋白的表达具有组织特异性，因此
SIRP
α
是一种停靠蛋白，通过响应胞外刺激招募及激活下游蛋白磷酸酶
。Oldenborg
首先报道了成熟血红细胞
(RBC
，
red blood cell) 通过
CD47
与脾脏巨噬细胞
SIRP
α
结合保护自身免遭后者的清除
。
随后研究人员发现
RBC
上的也能与单核细胞
SIRP
α
结合从而抑制依赖
Fc
γ
受体的吞噬作用，这是通过对吞噬作用中的关键分子肌球蛋白
‑
IIA(myosin
‑
IIA)
去磷酸化作用实现的
。
临床上多种实体瘤和血液恶性肿瘤中都发现了
CD47
高表达的现象，包括急
性髓样白血病
(AML)、
急性淋巴白血病
(ALL)本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
靶向
SIRP
α
和
PD
‑
L1
的双特异性抗体或其抗原结合片段，其特征在于，包括：
SIRP
α
结合域和
PD
‑
L1
结合域；其中，所述
SIRP
α
结合域包括：重链可变区和轻链可变区；所述重链可变区包括：氨基酸序列分别如
SEQ ID NO:3、4、5
所示的
VHCDR1、VHCDR2
和
VHCDR3
；所述轻链可变区包括：氨基酸序列分别如
SEQ ID NO:37、38、9
所示的
VLCDR1、VLCDR2
和
VLCDR3
；所述
PD
‑
L1
结合域包括：
VHH
片段，所述
VHH
片段包括：氨基酸序列分别如
SEQ ID NO:63、64、65
所示的
CDR1、CDR2
和
CDR3。2.
根据权利要求1所述的靶向
SIRP
α
和
PD
‑
L1
的双特异性抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述
SIRP
α
结合域的重链可变区的序列如
SEQ ID NO:17
所示或与其具有至少
85
％序列同一性；或者，所述
SIRP
α
结合域的轻链可变区的序列选自
SEQ IDNO:18
或与其具有至少
85
％序列同一性
。3.
根据权利要求1所述的靶向
SIRP
α
和
PD
‑
L1
的双特异性抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述
VHH
片段的序列如
SEQ ID NO:62
所示或与其具有至少
85
％序列同一性
。4.
根据权利要求1所述的靶向
SIRP
α
和
PD
‑
L1
的双特异性抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述双特异性抗体或其抗原结合片段还包括：选自人源
IgG1、IgG2、IgG3、
或
IgG4
或其变体的重链恒定区；以及选自人源
κ
、
λ
链或其变体的轻链恒定区
。5.
根据权利要求4所述的靶向
SIRP
α
和
PD
‑
L1
的双特异性抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述重链恒定区包含：
Fc
片段或其变体；所述
Fc
片段的变体来源于
IgG1
，根据
EU
计数，包括突变位点：
L234A、L235A、K338A。6.
根据权利要求4所述的靶向
SIRP
α
和
PD
‑
L1
的双特异性抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述双特异性抗体或其抗原结合片段包括：第一多肽链和第二多肽链；所述第一多肽链包括：所述
SIRP
α
结合域的重链可变区
、
所述重链恒定区，以及所述
VHH
片段；所述
VHH
片段与所述
SIRP
α
结合域的重链可变区的
N
端融合，或者，所述
VHH
片段与所述重链恒定区的
C
端融合；所述第二多肽链包括：所述
SIRP
α
结合域的轻链可变区
、
所述轻链恒定区
。7.
根据权利要求4所述的靶向
SIRP
α
和
PD
‑
L1
的双特异性抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述双特异性抗体或其抗原结合片段包括：第一多肽链和第二多肽链；所述第一多肽链包括：所述
SIRP
α
结合域的重链可变区和所述重链恒定区所述第二多肽链包括：所述
SIRP
α
结合域的轻链可变区
、
所述轻链恒定区
、
以及所述
VHH
片段；所述
VHH
片段与所述
SIRP
α
结合域的轻链可变区的
N
端融合
。8.
根据权利要求6或7所述的靶向
SIRP
α
和
PD
‑
L1
的双特异性抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述双特异性抗体或其抗原结合片段为包括2条所述第一多肽链和2条所述第二多肽链的对称结构
。9.
根据权利要求6或7所述的靶向
SIRP
α
和
PD
‑
L1
的双特异性抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述双特异性抗体或其抗原结合片段还包括：连接序列；优选的，所述连接序列选择...

【专利技术属性】
技术研发人员：屈向东，潘琴，都业杰，刘小芳，
申请(专利权)人：启愈生物技术上海有限公司，
类型：发明
国别省市：