一种利用烟草毛状根高效扩繁制造技术

本发明专利技术涉及植物组织培养及微生物培养技术领域，尤其涉及一种利用烟草毛状根高效扩繁丛枝菌根真菌孢子的方法，包括以下步骤：首先利用发根农杆菌对烟草外植体叶片进行侵染，诱导出毛状根；在毛状根进行除菌培养后，进行继代与扩繁；截取绒毛丰富生长旺盛的毛状根于

【技术实现步骤摘要】
一种利用烟草毛状根高效扩繁AM真菌孢子的方法


[0001]本专利技术涉及植物组织培养及微生物培养
，尤其涉及一种利用烟草毛状根高效扩繁
AM
真菌孢子的方法
。

技术介绍

[0002]由于
AM
真菌专性共生这一特性，使其目前尚未实现无宿主培养，早期
AM
真菌各种培养方法都依托于与完整的植物体建立共生体系的前提下，包括植物土壤盆栽法，营养液膜法
、
汽雾栽培法
、
培养基培养法等
。
[0003]目前土壤盆栽法是常用的
AM
真菌扩繁和菌剂制备的主要方法，但这种方法费时费力
、
污染率高，无法获得纯净的
AM
真菌孢子，这限制了后续
AM
真菌与宿主植物共生机理
、AM
真菌纯培养及提高宿主抗逆性，同时植物毛状根与
AM
真菌建立了共生体系，但都普遍新生孢子体积小
、
产量低
、
孢子难以成熟等问题
。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是为了解决现有技术中以下缺点，植物毛状根与
AM
真菌建立了共生体系，但都普遍新生孢子体积小
、
产量低
、
孢子难以成熟等问题，而提出的一种利用烟草毛状根高效扩繁
AM
真菌孢子的方法
。
[0005]为了实现上述目的，本专利技术采用了如下技术方案：
[0006]一种利用烟草毛状根高效扩繁
AM
真菌孢子的方法，包括以下步骤：
[0007]S1:
将发根农杆菌进行活化培养，烟草毛状根的诱导；首先将烟草种子用洗洁精浸泡
5min
，流水冲洗干净后，用
75
％酒精和
10
％次氯酸钠消毒液表面灭菌，后用无菌水冲洗干净转入
MS
固体培养基中，于
25℃
，
14h/d
光照培养获得无菌苗
,
将烟草叶片切成约为
1.5cm
×
1.5cm
左右大小后，放置于
MS
固体培养基上，预培养3天后放入制备好的侵染液中
8min
，取出叶片放置于无菌滤纸上吸干菌液，转入共培养培养基中，在
25℃
暗下培养
3d,
而后将叶片转移到含有抗生素的抑菌培养基中，并逐渐降低抗生素的浓度，直至毛状根周围不再有发根农杆菌，待毛状根稳定后转入
1/2MS(
不含激素和抗生素
)
的固体培养基中进行继代培养；
[0008]S2:
装有孢子的离心管表面喷洒酒精后置于超净工作台中，加入无菌水反复冲洗5次
,
冲洗完毕后加入
75
％酒精消毒后，再次用无菌水反复冲洗5次
,
再分别加入2％氯胺
T(w/v)+0.25
％
Tween
‑
20(v/v)
混合制成的
A
液和
0.02
％硫酸链霉素
(w/v)+0.01
％硫酸庆大霉素
(w/v)
混合制成
B
液消毒处理后，用无菌水冲洗5次，最后将孢子放置于无菌滤纸上吸干水分，并立即用牙签将孢子逐一接种到萌发培养基中；
[0009]S3:
将烟草毛状根转移到共生培养基上，再将
AM
真菌孢子表面消毒及萌发后得到的萌发
AM
真菌孢子按照打孔补位法接种到烟草毛状根根尖处，于
25℃
暗培养，待孢子萌发菌丝侵入毛状根后建立双重培养体系；
[0010]S4:
在共培养4个月后将含有新生孢子及菌丝的培养基转移到新的共培养培养基上
。
[0011]优选的，发根农杆菌进行活化培养的方法：将发根农杆菌画线接种于
YEB
固体培养基中培养
48h
后，挑取单菌落于
YEB
液体培养基中振荡培养
12h
，再将
1ml
菌液转移至
YEB
培养液中扩大培养至
OD600
值为
0.6
～
0.8。
[0012]优选的，发根农杆菌选用
C58C1
发根农杆菌
。
[0013]优选的，共培养的培养基为
MS
培养基
、pH 5.8
‑
6.0
，培养温度为
25℃
，培养时间为3天
。
[0014]优选的，抑菌培养基包括
MS
培养基
、500mg/L
头孢霉素
、500mg/L
特美汀，抑菌培养基的
pH 5.8
‑
6.0。
[0015]优选的，除菌培养基包括
MS
培养基
、30mg/L
利福平
、500mg/L
头孢霉素
、500mg/L
特美汀，除菌培养基的
pH 5.8
‑
6.0。
[0016]优选的，孢子消毒条件为先用
75
％酒精消毒
30
‑
60s
，2％氯胺
T(w/v)+0.25
％
Tween
‑
20(v/v)
混合制成的
A
液处理时间为8‑
12min
，而
0.02
％硫酸链霉素
(w/v)+0.01
％硫酸庆大霉素
(w/v)
混合制成
B
液处理时间为8‑
12min。
[0017]优选的，孢子萌发培养基包括
0.8
％水琼脂
、450pg/L
独脚金内酯
GR24。
[0018]优选的，共生培养基包括
MSR
培养基
、10mmol/L2
‑
吗啉乙磺酸
、450pg/L
独脚金内酯
GR24、
植物凝胶，培养基
pH 5.8
‑
6.0。
[0019]优选的，打孔补位法包括：利用直径为
0.5cm
的无菌打孔器在毛状根旁边打孔，并移除培养基，再用另一个同样孔径的无菌打孔器将萌发的孢子连同培养基取出，并转移到毛状根旁的孔径中，尽量让菌丝生长的方向正对着烟草毛状根
。
[0020]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
[0021]1、
通过在培养基中添加一定浓度本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种利用烟草毛状根高效扩繁
AM
真菌孢子的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1:
将发根农杆菌进行活化培养，烟草毛状根的诱导；首先将烟草种子用洗洁精浸泡
5min
，流水冲洗干净后，用
75
％酒精和
10
％次氯酸钠消毒液表面灭菌，后用无菌水冲洗干净转入
MS
固体培养基中，于
25℃
，
14h/d
光照培养获得无菌苗
,
将烟草叶片切成约为
1.5cm
×
1.5cm
左右大小后，放置于
MS
固体培养基上，预培养3天后放入制备好的侵染液中
8min
，取出叶片放置于无菌滤纸上吸干菌液，转入共培养培养基中，在
25℃
暗下培养
3d,
而后将叶片转移到含有抗生素的抑菌培养基中，并逐渐降低抗生素的浓度，直至毛状根周围不再有发根农杆菌，待毛状根稳定后转入
1/2MS(
不含激素和抗生素
)
的固体培养基中进行继代培养；
S2:
装有孢子的离心管表面喷洒酒精后置于超净工作台中，加入无菌水反复冲洗5次
,
冲洗完毕后加入
75
％酒精消毒后，再次用无菌水反复冲洗5次
,
再分别加入2％氯胺
T(w/v)+0.25
％
Tween
‑
20(v/v)
混合制成的
A
液和
0.02
％硫酸链霉素
(w/v)+0.01
％硫酸庆大霉素
(w/v)
混合制成
B
液消毒处理后，用无菌水冲洗5次，最后将孢子放置于无菌滤纸上吸干水分，并立即用牙签将孢子逐一接种到萌发培养基中；
S3:
将烟草毛状根转移到共生培养基上，再将
AM
真菌孢子表面消毒及萌发后得到的萌发
AM
真菌孢子按照打孔补位法接种到烟草毛状根根尖处，于
25℃
暗培养，待孢子萌发菌丝侵入毛状根后建立双重培养体系；
S4:
在共培养4个月后将含有新生孢子及菌丝的培养基转移到新的共培养培养基上
。2.
根据权利要求1所述的一种利用烟草毛状根高效扩繁
AM
真菌孢子的方法，其特征在于，发根农杆菌进行活化培养的方法：将发根农杆菌画线接种于
YEB
固体培养基中培养
48h
后，挑取单菌落于
YEB
液体培养基中振荡培养
12h
，再将
1ml
菌液转移至
YEB
培养液中扩大培养至
OD600
值为
0.6
～
0.8。3.
根据权利要求1所述的一种利用烟草毛状根高效扩繁
AM
真菌孢子...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢燕回，韦学平，李俊霖，石保峰，卢昌友，首安发，
申请(专利权)人：中国烟草总公司广西壮族自治区公司，
类型：发明
国别省市：