基于制造技术

本发明专利技术公开了一种基于

【技术实现步骤摘要】
基于Cre
‑
LoxP和CRISPR的核酸构建体及其应用


[0001]本专利技术属于基因编辑领域，具体涉及一种基于
Cre
‑
LoxP
和
CRISPR
‑
Cas
的核酸构建体及其在原位
CRISPR
遗传筛选和单基因扰动品系的制备中的应用
。

技术介绍

[0002]体内遗传筛选
、CRISPR
基因编辑：潜力与瓶颈
。
遗传筛选是解码人类基因功能的重要策略
。2014
年，颠覆性的
CRISPR
‑
Cas9
遗传筛选技术横空出世
(Shalem et al.,2014)
立即成为遗传筛选的首选方法
。
大多数
CRISPR
遗传筛选都在体外
(
通常是肿瘤细胞里
)
进行
。
但是，很多生理
、
病理现象无法在体外
(
完全
)
再现，因为体外体系
(
包括类器官
)
无法
(
完全
)
模拟体内的复杂的细胞相互作用
、
免疫反应
、
细胞外基质结构等条件
。
[0003]因此，人们已经尝试体内
CRISPR
筛选，较为常见的方法是将
sgRNA/>病毒文库引入肿瘤细胞，再将其输入小鼠体内，以筛选调控肿瘤细胞生长
、
转移或其他功能
(
如免疫耐受性
)
的基因
。
例如，将基因组规模的
CRISPR
文库通过病毒转导在非转移的癌细胞系，然后皮下移植给裸鼠后，发现有部分细胞形成转移灶
。
在病灶处对
sgRNA
进行测序，揭示了富集的
sgRNA
，从而发现能抑制肿瘤转移的靶基因
(Chen et al.,2015)。
但是，更重要
、
也更具挑战性的体内筛选，需在小鼠原代细胞进行，这正成为基因功能组学的前沿领域
。
这类体内筛选分为移植筛选和原位筛选，前者需从小鼠体内分离出原代细胞，在体外培养
、
扩增
、
引入病毒
sgRNA
文库，然后植入体内，过程繁琐，容易造成假象，并且只适用于可以移植并易被病毒转染的少数细胞类型
(
目前主要是血细胞
)
，从而有巨大局限性
(Chen et al.,2021
；
Dong et al.,2019
；
Huang et al.,2021
；
LaFleur et al.,2019
；
Wei et al.,2019)
；后者则是直接把文库注射入体内，理论上简单易行，结果可靠，应用广泛，从而避免了这些局限性，应该是理想的筛选形式
。
但是，原位筛选的前提是能有效
、
均匀地将
sgRNA
文库输入体内细胞，而这依然是久攻未克的难关
。
因此，原位筛选鲜有报道，而且都聚集3个靶器官
(
肝
、
脑
、
肺
)(Jin et al.,2020
；
Rogers et al.,2018
；
Wang et al.,2018
；
Wertz et al.,2020)。
[0004]综上所述，
CRISPR
遗传筛选有其重要发展瓶颈，严重妨碍了人类基因功能的破译和人类疾病的诊断治疗，因此亟待突破
。
[0005]Cre
‑
Lox
重组系统
。Cre
‑
LoxP
体系是一种特定位点的重组技术
(McLellan et al.,2017)
，可在
DNA
的特定位点上执行删除
、
插入
、
易位及倒位
。
该系统由
Cre
重组酶和其识别序列
LoxP
构成
。Cre(Cause recombination)
是噬菌体
P1
产生的酪氨酸位点特异性重组酶，
LoxP(Locus Of X
‑
over P1)
是
P1
噬菌体基因组中
34bp
的特殊位点序列，由
8bp
核心序列
(spacer)
和其两边的两段
13bp
反向回文重复对称序列
(arm)
组成
。
在基因操作中，一对
LoxP
序列被插入靶基因序列两侧；被一对
LoxP
序列包围的序列称为
floxed(
即
Flanked by loxP)
序列
。
如果
floxed
序列两侧的
LoxP
序列方向相同，
Cre
进行重组时，
floxed
序列将会被删除，而靶基因只残留一个
LoxP
，其序列携带原上游
LoxP
的5’
arm
和原下游
LoxP
的3’
arm。
文献已经报道了两大类
LoxP
突变体
,
各有用途
。
第一类突变发生在
arm。
例如，
Lox71
和
LoxKR3
分别携带5’
和3’
arm
的点突变，两者能有效重组，但其重组产生的
LoxP
则两臂同时携带突
变，因而难以继续重组
(Araki et al.,2010)。
第二类
LoxP
突变发生在
spacer。
例如，将
spacer
换成
U6
启动子
TATA box
序列，可使
LoxP
变体
(
称为
TATA
‑
Lox)
兼有
TATA box
功能；将
TATA
‑
Lox
镶嵌到
U6
启动子，不影响其转录但使其兼具重组功能，即该修饰的启动子具转录
‑
重组双功能
(Ventura et al.,本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种
LoxP
核酸组合，其特征在于，所述
LoxP
核酸组合包括
TATA
‑
Lox71
序列和
TATA
‑
LoxTC9
序列；其中，所述
TATA
‑
Lox71
序列如
SEQ ID NO:1
所示，所述
TATA
‑
LoxTC9
序列如
SEQ ID NO:2
所示
。2.
一种
Cre
‑
LoxP
重组系统，其特征在于，所述
Cre
‑
LoxP
重组系统包括
Cre
酶和如权利要求1所述的
LoxP
核酸组合；所述
LoxP
核酸组合在所述
Cre
酶的催化下只发生一次重组
。3.
一种编码
Cre
‑
LoxP
重组系统和
CRISPR
基因编辑系统的核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体包括
U6
启动子
、
串联的
sgRNA
表达元件，以及用于将所述核酸构建体导入靶细胞的基因组中的转座子反向末端重复序列；其中，所述
U6
启动子包含
TATA
‑
Lox71
序列，所述
TATA
‑
Lox71
序列的核苷酸序列如
SEQ ID NO:1
所示，所述
U6
启动子的核苷酸序列如
SEQ ID NO:3
所示；所述
sgRNA
表达元件自5’
端至3’
端包括靶向目的基因的
sgRNA、
转录终止子和
TATA
‑
LoxTC9
序列；所述
TATA
‑
LoxTC9
序列的核苷酸序列如
SEQ ID NO:2
所示；如权利要求1所述的
LoxP
核酸组合在
Cre
酶的作用下发生一次重组而诱导
sgRNA
表达，所述
sgRNA
再募集
Cas
蛋白或其衍生物以扰动靶基因，所述扰动例如为切割
、
沉默或激活
。4.
如权利要求3所述的核酸构建体，其特征在于，所述
sgRNA
表达元件的数量为2个以上，例如
60
～
150
个；和
/
或，所述转录终止子为

【专利技术属性】
技术研发人员：池天，刘波，荆振宇，张校铭，毛少帅，陈玉鑫，
申请(专利权)人：上海科技大学，
类型：发明
国别省市：