α-异丙基苹果酸合酶突变体制造技术

本发明专利技术涉及微生物技术领域，具体涉及

【技术实现步骤摘要】
α
‑
异丙基苹果酸合酶突变体、重组微生物及其应用


[0001]本专利技术涉及微生物
，具体涉及
α
‑
异丙基苹果酸合酶突变体
、
重组微生物及其应用
。

技术介绍

[0002]支链氨基酸
(branch chain amino acid
，
BCAA)
包括缬氨酸
、
亮氨酸和异亮氨酸
。
其中，
L
‑
缬氨酸
(L
‑
valine)
，化学名称为
L
‑
α
‑
氨基异戊酸，分子式为
C5H
11
NO2，相对分子质量为
117.15。L
‑
缬氨酸呈白色结晶或结晶性粉末，无臭，味苦，在水中
25℃
的溶解度为
88.5g/L
，
50℃
的溶解度为
96.2g/L
，不溶于冷乙醇
、
乙醚
、
丙酮，等电点为
5.96
，熔点为
315℃。
[0003]L
‑
缬氨酸是人体八种必需氨基酸之一，因其特殊的结构和功能，在人类生命代谢中具有特别重要的地位
。L
‑
缬氨酸可以广泛应用于医药工业
、
食品工业和饲料工业等
。
其中，在医药工业中，
L
‑
缬氨酸可作为氨基酸输液
、
综合氨基酸制剂的主要成分，可治疗肝功能衰竭
、
中枢神经系统功能紊乱
。
在食品工业中，
L
‑
缬氨酸可用作食品添加剂
、
营养增补液及风味剂等
。L
‑
缬氨酸也可用作氨基酸功能饮料与运动员饮料，具有形成肌肉
、
强化肝功能
、
减轻肌肉疲劳等作用
。
在饲料工业中，
L
‑
缬氨酸对动物的乳腺组织分泌乳汁具有重要的促进作用
。
[0004]目前，
L
‑
缬氨酸的生产方法主要包括三种：提取法
、
化学合成法
、
微生物发酵法
。
提取法和化学合成法由于原料来源受到限制
、
生产成本高
、
污染环境等问题，难以实现工业化生产
。
微生物发酵法生产
L
‑
缬氨酸具有原料成本低
、
反应条件温和
、
容易实现大规模生产等优点，是目前生产
L
‑
缬氨酸最主要的方法
。
但目前
L
‑
缬氨酸菌种的发酵性能仍较差，且副产物亮氨酸的含量较高，导致转化率仍较低，较难满足大规模工业化生产的需求
。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的之一是提供
α
‑
异丙基苹果酸合酶突变体及其应用
。
本专利技术的另一目的是提供表达
α
‑
异丙基苹果酸合酶突变体的重组微生物及其应用
。
[0006]具体地，本专利技术提供以下技术方案：
[0007]本专利技术提供
α
‑
异丙基苹果酸合酶突变体，以谷氨酸棒杆菌野生型
α
‑
异丙基苹果酸合酶为参考序列，
α
‑
异丙基苹果酸合酶突变体含有第
87
位脯氨酸被除脯氨酸以外的氨基酸取代的突变
。
[0008]本专利技术中，
α
‑
异丙基苹果酸合酶由
leuA
基因编码，催化
α
‑
酮基异戊酸与乙酰
‑
CoA
反应生成
a
‑
异丙基苹果酸，是亮氨酸合成末端途径中的第一个酶，也是亮氨酸合成途径的关键酶，该酶受到亮氨酸的反馈抑制和转录弱化调控
。
谷氨酸棒杆菌野生型
α
‑
异丙基苹果酸合酶的氨基酸序列如
SEQ ID NO.1
所示，其编码基因
leuA
的核苷酸序列如
SEQ ID NO.2
所示
。
[0009]本专利技术发现，
α
‑
异丙基苹果酸合酶第
87
位脯氨酸突变为其他氨基酸能够显著降低该酶的催化活性，减少微生物中由
α
‑
酮基异戊酸
、
乙酰
‑
CoA
反应生成
a
‑
异丙基苹果酸的代
谢通量，进而减少亮氨酸的合成，增加缬氨酸和异亮氨酸合成途径的代谢通量，进而增强缬氨酸和异亮氨酸以及以缬氨酸
、
异亮氨酸作为前体物质的下游代谢产物的合成
。
此外，本专利技术还发现，
α
‑
异丙基苹果酸合酶第
87
位脯氨酸突变为其他氨基酸，不会导致
α
‑
异丙基苹果酸合酶的完全失活，其能够少量合成亮氨酸供菌株生长
。
[0010]优选地，以谷氨酸棒杆菌野生型
α
‑
异丙基苹果酸合酶为参考序列，
α
‑
异丙基苹果酸合酶突变体含有第
87
位脯氨酸被亮氨酸
、
缬氨酸或异亮氨酸取代的突变
。
[0011]在第
87
位脯氨酸突变的各种突变体中，上述三种突变体不仅能够显著降低
α
‑
异丙基苹果酸合酶的活性，减少菌株的亮氨酸合成，促进缬氨酸
、
异亮氨酸及其衍生物的合成，而且还能够很好地保证菌株的生长性能，表达这三个突变体的工程菌株具有优异的发酵性能
。
[0012]具体地，所述
α
‑
异丙基苹果酸合酶突变体具有如
SEQ ID NO.3
‑8任一所示的氨基酸序列
。
[0013]上述突变体序列中，
SEQ ID NO.3
‑5所示序列为将
SEQ ID NO.1
所示序列的第
87
位分别替换为亮氨酸
、
缬氨酸
、
异亮氨酸
(
编码基因序列相应地由
CCT
突变为
CTT、GTT、ATT)
，同时将其第1位氨基酸替换为缬氨酸得到
。SEQ ID NO.6
‑8所示序列为将
SEQ I本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
α
‑
异丙基苹果酸合酶突变体，其特征在于，以谷氨酸棒杆菌野生型
α
‑
异丙基苹果酸合酶为参考序列，所述
α
‑
异丙基苹果酸合酶突变体含有第
87
位脯氨酸被除脯氨酸以外的氨基酸取代的突变
。2.
根据权利要求1所述的
α
‑
异丙基苹果酸合酶突变体，其特征在于，以谷氨酸棒杆菌野生型
α
‑
异丙基苹果酸合酶为参考序列，所述
α
‑
异丙基苹果酸合酶突变体含有第
87
位脯氨酸被亮氨酸
、
缬氨酸或异亮氨酸取代的突变
。3.
根据权利要求1或2所述的
α
‑
异丙基苹果酸合酶突变体，其特征在于，所述
α
‑
异丙基苹果酸合酶突变体具有如
SEQ ID NO.3
‑8任一所示的氨基酸序列
。4.
编码权利要求1～3任一项所述的
α
‑
异丙基苹果酸合酶突变体的基因
。5.
含有权利要求4所述的基因的生物材料，其特征在于，所述生物材料为重组
DNA、
载体或宿主细胞
。6.
一种重组微生物，其特征在于，所述重组微生物表达权利要求1～3任一项所述的
α
‑
异丙基苹果酸合酶突变体，且不表达其出发菌株所具有的
α
‑
异丙基苹果酸合酶；优选地，所述重组微生物中，编码
α
‑
异丙基苹果酸合酶的基因被权利要求4所述的基因取代
。7.
根据权利要求6所述的重组微生物，其特征在于，所述重组微生物为棒杆菌属细菌或短杆菌属细菌；优选地，所述棒杆菌属细菌为选自谷氨酸棒杆菌
(Coryne...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴涛，张晓云，栾明月，李鑫磊，薛婷莉，胡丹，赵津津，李岩，
申请(专利权)人：胡丹，
类型：发明
国别省市：