一种源自大肠杆菌的醇脱氢酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种源自大肠杆菌的醇脱氢酶突变体及其应用，所述的醇脱氢酶突变体是在醇脱氢酶

【技术实现步骤摘要】
一种源自大肠杆菌的醇脱氢酶突变体及其应用
(一)

[0001]本专利技术属于生物催化领域，涉及一种醇脱氢酶突变体
YahK
‑
E208A/A209R
及其催化糠醛合成糠醇的应用
。
(二)
技术介绍

[0002]生物质资源作为自然界中碳基可再生资源，来源丰富
、
成本低廉，是可持续生产化学品和燃料的最佳原料
。
基于纤维素和半纤维素的水解，最终可以实现向高附加值的生物质基平台分子的转化
。
其中含有呋喃环的糠醛是连接生物质资源与高附加值化学品的桥梁
。
在糠醛的还原产物中，糠醇是最重要的下游产物之一，可广泛应用于化工行业，具有重要的经济价值和实际意义
。
[0003]醇脱氢酶催化糠醛还原生成糠醇需要辅酶的参与，而辅酶
NAD(H)
或
NADP(H)
价格较昂贵
。
两种辅酶相比而言，辅酶
NADP(H)
的价格约为辅酶
NAD(H)
偏好型的5倍，并且更不稳定
。
底物糠醛具有活泼的醛官能团，大多数的醇脱氢酶不耐受高浓度的糠醛
。
利用蛋白质工程技术改造醇脱氢酶，提高其催化活力，使其在还原高浓度糠醛时具备更高的催化活力，有助于降低实际生产过程中的经济成本
。
另外通过构建辅酶再生系统可以有效解决氧化还原反应中辅酶需求的问题，保证辅酶的持续供给
。
(三)专利
技术实现思路

[0004]本专利技术目的是提供一种源自大肠杆菌的醇脱氢酶突变体及其在催化糠醛还原生成糠醇中的应用，本专利技术选取源自
E.coli
的
YahK
基因作为研究对象，通过序列分析，成功获得催化活力得到了明显提高的突变体
YahK
‑
E208A/A209R。
醇脱氢酶
YahK
在催化糠醛还原生成糠醇时更偏好辅酶
NADP(H)
，利用
NADP(H)
合成糠醇的得率为
63.45
％，而改造获得的醇脱氢酶突变体
YahK
‑
E208A/A209R
利用辅酶
NADP(H)
在催化
500mM
糠醛还原生成糠醇的反应中，得率为
93.87
％，是野生型的
1.48
倍
。
[0005]本专利技术采用的技术方案是：
[0006]本专利技术提供一种源自大肠杆菌的醇脱氢酶突变体
(
记为
YahK
‑
E208A/A209R)
，所述醇脱氢酶突变体
YahK
‑
E208A/A209R
是将
SEQ ID NO.1
所示氨基酸序列中第
208
位谷氨酸突变为丙氨酸，同时
209
位丙氨酸突变为精氨酸获得的
。
所述醇脱氢酶双突变体
YahK
‑
E208A/A209R
的氨基酸序列为
SEQ ID NO.3
所示
。
[0007]本专利技术还提供一种所述醇脱氢酶突变体
YahK
‑
E208A/A209R
编码基因，所述编码基因的核苷酸序列为
SEQ ID NO.4
所示
。
[0008]本专利技术还涉及一种含所述醇脱氢酶突变体
YahK
‑
E208A/A209R
编码基因的重组载体及所述重组载体构建的基因工程菌
。
所述重组载体以
pET28a
为基础载体，所述基因工程菌以
E.coli BL21(DE3)
为宿主菌
。
[0009]所述基因工程菌由如下方法得到：以质粒
pET28a
‑
YahK
为模板，利用带有突变碱基的引物经过反向
PCR
扩增全质粒，得到的
PCR
产物经
DpnⅠ酶消化甲基化的模板，酶切产物转
化至大肠杆菌
E.coli BL21(DE3)
中，即可得到所述含醇脱氢酶突变体
YahK
‑
E208A
基因的工程菌
E.coli BL21(DE3)/pET28a
‑
YahK
‑
E208A
，其中含重组醇脱氢酶突变体编码基因的质粒命名为
pET28a
‑
YahK
‑
E208A。
类似地，以质粒为
pET28a
‑
YahK
‑
E208A
模板，在
209
位点引入
A209R
突变，获得重组质粒
pET28a
‑
YahK
‑
E208A/A209R
及对应的基因工程菌
E.coli BL21(DE3)/pET28a
‑
YahK
‑
E208A/A209R。
[0010]此外，本专利技术还提供一种所述醇脱氢酶突变体
YahK
‑
E208A/A209R
在催化糠醛还原生成糠醇中的应用，所述应用为：将含醇脱氢酶突变体编码基因的工程菌
E.coli BL21(DE3)/pET28a
‑
YahK
‑
E208A/A209R
经诱导表达获得的湿菌体为催化剂，以糠醛为底物，加入
NADPH、
辅助酶和辅底物，以
pH 4
‑9缓冲液为反应介质构成反应体系，在
20
‑
50℃、500
ꢀ‑
800rpm
条件下反应完全后
(
优选
30℃、600rpm
条件下反应
6h)
，获得含糠醇反应液，反应液分离纯化获得糠醇；所述辅助酶包括葡萄糖脱氢酶
、
异丙醇脱氢酶
、
甲酸脱氢酶；所述辅底物包括葡萄糖
、
异丙醇
、
甲酸钠；所述辅酶和辅底物构成辅酶体系：葡萄糖脱氢酶
/
葡萄糖体系
、
异丙醇脱氢酶
/
异丙醇体系
、
甲酸脱氢酶
/
甲酸钠体系
。
所述催化剂与辅助酶质量比为
0.5
‑
2.5:1
，优选
2:1。
[0011]进一步，所述反应体系中，催化剂用量以湿菌体计
20
‑
100g/L本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种源自大肠杆菌的醇脱氢酶突变体，其特征在于，所述醇脱氢酶突变体是将
SEQ ID N0.1
所示氨基酸序列第
208
位谷氨酸突变为丙氨酸，同时
209
位丙氨酸突变为精氨酸获得
。2.
一种含权利要求1所述醇脱氢酶突变体编码基因的重组载体
。3.
一种由权利要求2所述重组载体构建的重组基因工程菌
。4.
一种权利要求1所述醇脱氢酶突变体在催化糠醛还原生成糠醇中的应用
。5.
如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述应用为：将含醇脱氢酶突变体编码基因的工程菌经诱导表达获得湿菌体为催化剂，以糠醛为底物，加入
NADPH、
辅酶和辅底物，以
pH 4
‑9缓冲液为反应介质构成反应体系，在
20
‑
50℃、500
‑
800rpm
条件下反应完全后，获得含糠醇反应液，反应液分离纯化获得糠醇；所述辅酶包括葡萄糖脱氢酶
、
异丙醇脱氢酶
、
甲酸脱氢酶；所述辅底物包括葡萄糖
、
异丙醇
、
甲酸钠
。6.
如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述反应体系中，催化剂用量以湿菌体计
20
‑
100g/L
，所述底糠醛酸加入量为
300
‑
500mM
，
NADPH
加入量为
0.1
‑
0.5mM
；辅底物与底物浓度比为
0.5
‑
2.5
：
1。7.
如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述葡萄糖脱氢酶
...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩梦阁，刘训，周雪婷，梁佐楠，冯颖婷，金礼俊，应向贤，章银军，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：