水稻谷枯病菌制造技术

本发明专利技术涉及一种水稻细菌性谷枯病菌

【技术实现步骤摘要】
水稻谷枯病菌CRISPR
‑
Cas12a的快速检测方法、其组合产品及试剂盒


[0001]本专利技术涉及分子生物检测
，具体涉及水稻细菌性谷枯病菌
CRISPR
‑
Cas12a
的快速检测方法
、
其组合产品及试剂盒
。

技术介绍

[0002]颖壳伯克氏菌
(Burkholderia glumae)
又称水稻细菌性谷枯病菌，是能够引起水稻细菌病害的重要病原菌，被列入我国进境植物检疫性有害生物名录中
。B.glumae
可危害多种禾本科植物，它不但侵害谷粒，还引起水稻秧苗腐烂，造成产量损失
。
此外，该病原还是人畜慢性肉芽肿性疾病的条件性致病菌
。
有研究表示，随着全球变暖，谷枯病侵染面积将逐步增大，发生更加严重，导致减产增多
。B.glumae
可在病田的杂草和土壤中越冬，也可随带菌稻种进行远距离传播，检疫风险很高
。
带菌稻种是病害远距离传播的主要途径，也是重要的初侵染源，因此，针对病原开发快速准确的检疫检测技术，开展稻种健康检测，是防止病害传播扩散，提高水稻病害的控制水平，保证我国水稻产业持续
、
健康发展的重要途径之一
。
目前较为常用的水稻细菌性谷枯病菌的检测方法主要包括传统的分离培养
、
血清学方法以及基于
PCR
的分子生物学检测方法，包括
RPA、
荧光
PCR
等
。
但传统检测方法通常步骤复杂
、
耗时较长；常规分子生物学检测方法整体操作过程依赖实验室仪器设备及专业技术人员，所以大都不能满足现场快速检测的需求
。
[0003]作为一种新兴的基因组编辑和调控工具，
CRISPR
技术的诞生和发展极大地改变了生物学领域的前进方向
。
近几年来，
CRISPR
系统及其相关蛋白的工作原理被逐渐揭示，由于其优越的灵敏度和特异性
,
该技术在多个领域开始发挥至关重要的作用
。
借助其新颖的核酸酶活性，人们打开了研发核酸检测新方法的大门
。CRISPR/Cas
系统也已被开发为一种快速
、
便携
、
低成本
、
高灵敏度的分子检测工具
。
[0004]Cas12
是一种Ⅱ类
Ⅴ
型
CRISPR
效应蛋白，可在
crRNA
引导下与靶标双链
DNA
结合并切割基因组
DNA。
当
Cas12
特异性结合和切割目标
dsDNA
后，具有非特异性切割单链
DNA(ssDNA)
的活性，利用
Cas12
的这种活性曾开发了一个被命名为
DETECTR(DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter)
的核酸检测系统
。DETECTR
将
RPA
等温扩增技术与
Cas12
相结合，扩增产物激活
Cas12
的附属切割活性，切割底物产生荧光信号，并且实现了单分子级别的灵敏度
。
该系统在单核苷酸多态性分析
、
癌症筛查
、
细菌和病毒感染检测以及耐药性筛查等方面有广泛的应用潜力
。
由于
Cas12
的靶标及底物均为
DNA
，稳定性较强，因此该系统对实验操作环境要求低，可应用于现场的快速检测
。
同时由于
Cas12
被靶标特异性激活后，能够非特异性地切割单链报告分子，该步骤具有信号放大作用，因而该技术相较于探针法等传统核酸检测技术具有更高的灵敏度
。
[0005]然而由于
Cas12
会切割
RPA
扩增的靶标
DNA
分子，并且激活后的
Cas12
切割包括引物在内的单链
DNA(ssDNA)
分子，从而阻碍扩增反应的进行，所以该系统中
RPA
核酸扩增和
CRISPR/Cas12
信号检测必须分开进行
。
而分步进行一方面增加了操作的复杂度和核酸被污
染风险，另一方面使整个检测耗时更长，不利于基层现场的快速检测应用
。

技术实现思路

[0006]鉴于现有技术的不足和分子生物检测技术的发展，本专利技术基于
CRISPR/Cas
报告系统，建立了可准确检测水稻细菌性谷枯病菌的可视化检测技术，实现了对水稻种子及植株上水稻细菌性谷枯病菌的快速现场检测
。
[0007]为解决上述技术问题，本专利技术旨在提供一种包含
CRISPR
‑
Cas
系统的组合产品，所述
CRISPR
‑
Cas
系统包括
Cas12a
和
crRNA
，其中，所述
crRNA
的序列为针对颖壳伯克氏菌的
ITS
基因序列设计的
Bg
‑
CrRNA。
[0008]在本专利技术的一个实施方案中，提供一种包含
CRISPR
‑
Cas
系统的组合产品，其中所述
Bg
‑
CrRNA
的序列为：
[0009]5’‑
UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGCCGUAUUCCAAUUGA GCC
‑3’
。
[0010]优选的，本专利技术所述包含
CRISPR
‑
Cas
系统的组合产品，其中所述
Cas12a
选自
FnCas12a、AsCas12a、LbCas12a、Lb5Cas12a、HkCas12a、OsCas12a、TsCas12a、BbCas12a、BoCas12a
或
Lb4Cas12a
中的一种
。
[0011]在另一个实施方案中，本专利技术所述包含
CRISPR
‑
Cas
系统的组合产品，其还包括缓冲体系和单链
DNA
报告分子
。
[0012]优选的，所述缓冲体系为
3.1NE Buffer
，其中使用
DEPC
‑
H2O。
[0013]优选的，本专利技术所述包含
CRISPR
‑
Cas
系统的组合产品，其中所述本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种包含
CRISPR
‑
Cas
系统的组合产品，其特征在于，所述
CRISPR
‑
Cas
系统包括
Cas12a
和
crRNA
，其中，所述
crRNA
的序列为针对颖壳伯克氏菌的
ITS
基因序列设计的
Bg
‑
CrRNA。2.
根据权利要求1所述的包含
CRISPR
‑
Cas
系统的组合产品，其中所述
Bg
‑
CrRNA
的序列为：5’‑
UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGCCGUAUUCCAAUUGA GCC
‑3’
。3.
根据权利要求1所述的包含
CRISPR
‑
Cas
系统的组合产品，其中所述
Cas12a
选自
FnCas12a、AsCas12a、LbCas12a、Lb5Cas12a、HkCas12a、OsCas12a、TsCas12a、BbCas12a、BoCas12a
或
Lb4Cas12a
中的一种
。4.
根据权利要求1所述的包含
CRISPR
‑
Cas
系统的组合产品，其还包括缓冲体系和单链
DNA
报告分子
。5.
根据权利要求4所述的包含
CRISPR
‑
Cas
系统的组合产品，其中所述的单链
DNA
报告分子为试纸条报告...

【专利技术属性】
技术研发人员：田茜，赵文军，方雪阳，孙羽佳，蔡璐璐，许沛冬，
申请(专利权)人：三亚中国检科院生物安全中心，
类型：发明
国别省市：