大肠杆菌发酵生产胶原三肽的诱导发酵工艺制造技术

本发明专利技术提供大肠杆菌发酵生产胶原三肽的诱导发酵工艺，涉及微生物发酵技术领域

【技术实现步骤摘要】
大肠杆菌发酵生产胶原三肽的诱导发酵工艺


[0001]本专利技术涉及微生物发酵
，具体为大肠杆菌发酵生产胶原三肽的诱导发酵工艺
。

技术介绍

[0002]大分子胶原蛋白是由
100
‑
1000
个氨基酸构成的胶原蛋白，人体对大分子胶原蛋白的吸收利用率有限
。
胶原蛋白肽是由
30
‑
50
个氨基酸组成，进入体内随机合成身体各部位的蛋白质或胶原蛋白，通常吸收率较低
。
胶原蛋白三肽是由3个氨基酸组成，可直接点对点被人体吸收，合成人体所需的胶原蛋白
。
[0003]在摄取量相同的前提下，比起普通的胶原蛋白肽，胶原蛋白三肽的吸收率会高出6‑7倍
。
尤其是胶原蛋白三肽中所含的
GPH
的吸收率更高
。
因为由3个氨基酸构成可直接被小肠吸收，经血液输送到肌肤，吸收的时间更快
。
[0004]胶原蛋白作为天然的生物资源，已广泛地应用在生物医药
、
化妆品
、
食品等行业中
。
目前，市场对胶原蛋白的需求量越来越大，其主要来源是利用酸碱法从动物机体中提取获得，这种胶原蛋白的产量虽然较高，但其具有水溶性差
、
纯度低，在临床上易出现排斥反应且存在病毒隐患等缺点，从而抑制了胶原蛋白在各行业的应用
。
[0005]随着生物技术的发展，人们利用转基因及基因重组技术表达胶原蛋白也获得了成功，如利用哺乳类细胞
、
昆虫细胞表达系统等，哺乳类细胞
、
昆虫细胞表达系统虽然能够表达结构复杂的真核细胞蛋白成分，但操作复杂，表达水平低，规模化生产成本较高，不易普遍推广使用
。
[0006]因此，本领域技术人员提供了大肠杆菌发酵生产胶原三肽的诱导发酵工艺，以解决上述
技术介绍
中提出的问题
。

技术实现思路

[0007](
一
)
解决的技术问题
[0008]针对现有技术的不足，本专利技术提供了大肠杆菌发酵生产胶原三肽的诱导发酵工艺，解决了哺乳类细胞
、
昆虫细胞表达系统虽然能够表达结构复杂的真核细胞蛋白成分，但操作复杂，表达水平低，规模化生产成本较高，不易普遍推广使用的问题
。
[0009](
二
)
技术方案
[0010]为实现以上目的，本专利技术通过以下技术方案予以实现：
[0011]大肠杆菌发酵生产胶原三肽的诱导发酵工艺，包括以下步骤：
[0012]步骤
S1.
溶液配制
[0013]1)
氨水配置：取
300m l
纯化水于补料瓶中经
121℃
灭菌
30min
降温至室温后在超净工作台中将等体积氨水加入该补料瓶中混匀待用；
[0014]2)10M
氢氧化钠配制：将称量好的
40g
氢氧化钠粉末加纯化水充分溶解后定容至
100m l
待用；
[0015]3)
活化培养基配制：将胰蛋白胨
、
酵母浸粉和氯化钠混合并添加一定量的水配置成活化培养基；
[0016]4)
溶液
T
配制：将一水合柠檬酸
、
七水合硫酸亚铁
、
七水合硫酸锌
、
一水合硫酸锰
、
四水合钼酸铵
、
五水合硫酸铜和磷酸混合并添加一定量的水配置成溶液
T
；
[0017]5)
发酵培养基配制：将酵母浸粉
、
一水合柠檬酸
、
硫酸铵
、
磷酸二氢钾
、
无水氯化钙
、
七水合硫酸亚铁
、
葡萄糖和硫酸镁混合并添加一定量的水配置成发酵培养基
。
[0018]步骤
S2.
菌种活化
[0019]1)
一级菌种活化：在超净工作台中，取冻存甘油菌
50
μ
l
接入到装有
50m l
活化培养基的
250m l
三角瓶中于恒温振荡器中培养，培养温度
37.0
±
1.0℃
，转速为
220
±
10rpm
，培养时间
12
‑
16h
；
[0020]2)
二级菌种扩增：在超净工作台中，取上述一级活化种子培养液
40ml
接入到装有
200ml
活化培养基的
1000ml
三角瓶中于恒温振荡器中培养，培养温度
37.0
±
1.0℃
，转速为
220
±
10rpm
，培养时间
3h
；
[0021]步骤
S3.
接种
[0022]二级菌种扩增合格后，将配制好的已灭菌葡萄糖硫酸镁溶液
30ml、
已过滤除菌的溶液
T 700
μ
l
加入发酵罐中并用氨水调节
pH
至
6.8
后，将合格的二级种子液接入
2L
发酵罐内开始发酵培养；
[0023]步骤
S4.
发酵参数控制
[0024]控制初始温度
37℃
，
pH
控制
6.8
，空气设置
500ml/min
，氧气设置0‑
200ml/min
，转速设置
500
‑
1400rpm
，溶氧控制
20
％
‑
30
％，当溶氧开始上升时开始流加补料培养基，同时伴随
pH
回升，当流加补料5‑
6h
后，
OD600
达到
150
并开始诱导，
IPTG
终浓度
1.0mM
，逐步降低温度至
30℃,
同时调整补料速度
、
调整氧气通气量以维持溶氧在
15
％
‑
30
％，诱导
10
小时至
OD600nm
值到
200
，监测发酵罐中的
OD600nm
值直至出现平台期发酵结束；
[0025]步骤
S5.
发酵过程中样品检测
[0026]1)
吸光度检测：补料开始后取样使用紫外分光光度计检测发酵液
OD600本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
大肠杆菌发酵生产胶原三肽的诱导发酵工艺，其特征在于，包括以下步骤：步骤
S1.
溶液配制
1)
氨水配置：取
300ml
纯化水于补料瓶中经
121℃
灭菌
30min
降温至室温后在超净工作台中将等体积氨水加入该补料瓶中混匀待用；
2)10M
氢氧化钠配制：将称量好的
40g
氢氧化钠粉末加纯化水充分溶解后定容至
100ml
待用；
3)
活化培养基配制：将胰蛋白胨
、
酵母浸粉和氯化钠混合并添加一定量的水配置成活化培养基；
4)
溶液
T
配制：将一水合柠檬酸
、
七水合硫酸亚铁
、
七水合硫酸锌
、
一水合硫酸锰
、
四水合钼酸铵
、
五水合硫酸铜和磷酸混合并添加一定量的水配置成溶液
T
；
5)
发酵培养基配制：将酵母浸粉
、
一水合柠檬酸
、
硫酸铵
、
磷酸二氢钾
、
无水氯化钙
、
七水合硫酸亚铁
、
葡萄糖和硫酸镁混合并添加一定量的水配置成发酵培养基
。
步骤
S2.
菌种活化
1)
一级菌种活化：在超净工作台中，取冻存甘油菌
50
μ
l
接入到装有
50ml
活化培养基的
250ml
三角瓶中于恒温振荡器中培养，培养温度
37.0
±
1.0℃
，转速为
220
±
10rpm
，培养时间
12
‑
16h
；
2)
二级菌种扩增：在超净工作台中，取上述一级活化种子培养液
40ml
接入到装有
200ml
活化培养基的
1000ml
三角瓶中于恒温振荡器中培养，培养温度
37.0
±
1.0℃
，转速为
220
±
10rpm
，培养时间
3h
；步骤
S3.
接种二级菌种扩增合格后，将配制好的已灭菌葡萄糖硫酸镁溶液
30ml、
已过滤除菌的溶液
T 700
μ
l
加入发酵罐中并用氨水调节
pH
至
6.8
后，将合格的二级种子液接入
2L
发酵罐内开始发酵培养；步骤
S4.
发酵参数控制控制初始温度
37℃
，
pH
控制
6.8
，空气设置
500ml/min
，氧气设置0‑
200ml/min
，转速设置
500
‑
1400rpm
，溶氧控制
20
％
‑
30
％，当溶氧开始上升时开始流加补料培养基，同时伴随
pH
回升，当流加补料5‑
6h
后，
OD600
达到
150
并开始诱导，
IPTG
终浓度
1.0mM
，逐步降低温度至
30℃,
同时调整补料速度
、
调整氧气通气量以维持溶氧在
15
％
‑
30
％，诱导
10
小时至
OD600nm
值到
200
，监测发酵罐中的
OD600nm
值直至出现平台期发酵结束；步骤
S5.
发酵过程中样品检测
1)
吸光度检测：补料开始后取样使用紫外分光光度计检测发酵液
OD600
的值并记录；
2)
空白对照取样：在添加诱导剂之前取样作为蛋白检测空白对照组；<...

【专利技术属性】
技术研发人员：连婕妮，
申请(专利权)人：北京诺尼瑞生物科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：