一种获取制造技术

本发明专利技术涉及细胞技术领域，具体涉及一种获取

【技术实现步骤摘要】
一种获取iPS细胞株的方法及其用途


[0001]本专利技术属于细胞
，具体涉及到一种获取
iPS
细胞株的方法及其用途
。

技术介绍

[0002]iPS 细胞首先于 2006 年从小鼠细胞中产生 (Takahashi 等人，
2006) 以及于 2007 年从人细胞中产生 (Takahashi 等人，
2007 ；
Yu 等人，
2007)。
这被认为是在干细胞研究中的 重要进展，因为它可使研究人员能够获得在研究中具有重要意义并且潜在地具有治疗应用 的多潜能干细胞，而不必争议性地使用胚胎
。
[0003]在人中，
iPSC
通常是从真皮成纤维细胞产生
。
然而，对于皮肤活组织检查的需 求和在体外扩展成纤维细胞数个传代的需要使其成为用于产生患者特异性干细胞的麻烦的来源
。
而且，先前的用于重编程人体细胞的方法是不方便的，因为它们需要从人受试者直接获取体细胞，或将细胞维持于费力的细胞培养系统中
。
[0004]目前，国际上已经开发出多种
iPSC
重编程方法，但各种方法均存在一定的局限性
。 如利用仙台病毒或者慢病毒携带不同的外源性转录因子在细胞中表达从而启动细胞重编程，该类方法的缺点在于基因组的随机插入可能会带来潜在风险，而且病毒诱导实验成本较高
。
利用脂质体包裹携带外源性转录因子重编程法，即在载体两侧插入了
loxPr/>位点，在完成诱导后通过瞬时表达
Cre
重组酶而删除此重编程构件，该系统在重编程完成后可对外源 基因进行删除，可以避免重编程因子的激活，从而降低了肿瘤生成的风险，但是此系统的重编程因子去除效率极低，并且删除重编程构件后，细胞内仍残留含
loxP
位点的载体
。
[0005]现有技术中重编程获得
iPSC
的时间大约在
30
‑
40
天左右，周期较长
。
并且现有技术中需要进行抽取血液，正常若是抽
8ml
血提取2×
107‑8×
107的
PBMC
，血液是人或高等动物体内循环系统中的液体组织，由血浆
、
血细胞构成，对维持生命起重要作用
。
若想到获取更多的
iPSC
便是需要抽取更多的血，本方案通过研究实现抽较少的血即可进行重编程获得高效率的
iPSC。
[0006]目前现有的诱导人体细胞为
iPS
细胞的技术体系普遍面临着效率低
、
诱导时间长，制备成本高等问题
。
[0007]细胞株常规采用单克隆挑选的方法进行后期获取，但是在生产化建库的时候则需要多次大量的重复的单克隆挑选操作，浪费时间不说，且单克隆在挑选的时候对于克隆的直径与面积都有指标要求，当没达到这个指标要求时候再后期挑选的克隆容易死掉不易存活
。
[0008]为便于建库及其使人
iPS
细胞在再生医学和疾病发生机制研究中得到广泛应用，必须探索一种高效的诱导策略，即能够缩短
iPS
细胞诱导时间以及提高重编程效率的重编程方法
。

技术实现思路

[0009]本申请为了提供一种低成本高重编程效率的
iPS
细胞株，通过如下步骤获得：
将外周血单个核细胞（
PBMC
）直接重编程获取
iPS
细胞株；所述
iPS
细胞株是通过
EDTA
消化获取，得到重编程效率较高的细胞克隆
。
[0010]进一步改进在于，通过电转将
PBMC
重编程获得
iPSC
克隆，随后用
EDTA
消化获取
iPS
细胞株
。
[0011]进一步改进在于，电转液体积用量的减少能够获取重编程效率较高的
iPSC
克隆
。
[0012]进一步改进在于，所述重编程的效率能够达到
0.25%。
[0013]进一步改进在于，所述
EDTA
消化液的浓度为
0.3
‑
0.5 mmol。
[0014]进一步改进在于，所述
PBMC
的初始细胞量在5×
104‑1×
106cells。
[0015]进一步改进在于，所述电转液的体积用量在5‑
100ul。
[0016]进一步改进在于，所述
PBMC
通过如下方法获得：将
PBMC
培养0ꢀ‑5天，计数，低速离心，并用
DPBS
洗一次，弃上清，通过培养基
I
对
PBMC
进行培养，所述培养基
I
包含基础培养基和添加剂；所述基础培养基包括
Stempro34、X
‑
VIVO15、IMDM、StemSpan
‑
XF、StemSpan
‑
H3000
中的任一种或者多种的组合；所述添加剂包括浓度体积浓度为1‑
100 ng/mL SCF、 1
‑
100 ng/mL FLT3L、1
‑
100 ng/mL IL3、1
‑
100 ng/mL IL6、100
‑
150ug/ml Transferrin、0.1
‑
5% HSA、Glutamax(1x)
中任意一种或者多种的组合
。
[0017]进一步改进在于，
PBMC
培养天数为1‑4天
。
[0018]进一步改进在于，所述
iPSC
通过电转获得，在电转后第一天，每孔补充
0.5
‑
5ml
培养基
II
，培养基
II
包括
E8、 0.1%
‑
5%
人血清白蛋白
、0
‑
10uM CHIR99021、0
‑
10uM PD0325901、0
‑
10uM A83
‑
01
中的中任意两种以上的组合
。
[0019]进一步改进在于，电转后第二天起，全换液，补1‑
5ml
所述培养基
II
，继续每天换液，至
iPSC
克隆出现
。
[0020]进一步改进在于，所述重编程系统包含一个或多个载体，所述一个或多个载体是质粒
。
[0021]进一步改进在于，所本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种获取
iPS
细胞株的方法，其特征在于，包括以下步骤：将外周血单个核细胞（
PBMC
）直接重编程获取
iPS
细胞株；所述
iPS
细胞株是通过
EDTA
消化获取，得到重编程效率较高的细胞克隆
。2.
如权利要求1所述的一种获取
iPS
细胞株的方法，其特征在于，通过电转将
PBMC
重编程获得
iPSC
克隆，随后用
EDTA
消化获取
iPS
细胞株
。3.
如权利要求2所述的一种获取
iPS
细胞株的方法，其特征在于，电转液体积用量的减少能够获取重编程效率较高的
iPSC
克隆
。4.
如权利要求1所述的一种获取
iPS
细胞株的方法，其特征在于，所述重编程的效率能够达到
0.25%。5.
如权利要求1所述的一种获取
iPS
细胞株的方法，其特征在于，所述
EDTA
消化液的浓度为
0.3
‑
0.5mmol。6.
如权利要求1所述的一种获取
iPS
细胞株的方法，其特征在于，所述
PBMC
的初始细胞量在5×
104‑1×
106cells。7.
如权利要求2所述的一种获取
iPS
细胞株的方法，其特征在于，所述电转液的体积用量在5‑
100ul。8.
如权利要求2所述的一种获取
iPS
细胞株的方法，其特征在于，所述
PBMC
通过如下方法获得：将
PBMC
培养0‑5天，计数，低速离心，并用
DPBS
洗一次，弃上清，通过培养基
I
对
PBMC
进行培养，所述培养基
I
包含基础培养基和添加剂；所述基础培养基包括
Stempro34、X
‑
VIVO15、IMDM、StemSpan
‑
XF、StemSpan
‑
H3000
中的任一种或者多种的组合；所述添加剂包括浓度体积浓度为1‑
100ng/mLSCF、1
‑
100ng/mLFLT3L、1
‑
100ng/mLIL3、1
‑
100ng/mLIL6、100
‑
150ug/mlTransfe...

【专利技术属性】
技术研发人员：王嘉显，潘芷伊，林敏，王莲慧，
申请(专利权)人：南京艾尔普再生医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：