一种用于制造技术

本发明专利技术公开了一种用于

【技术实现步骤摘要】
一种用于PKD1基因突变检测的引物组、试剂盒及检测方法


[0001]本专利技术涉及基因检测
，具体涉及一种用于
PKD1
基因突变检测的引物组
、
试剂盒及检测方法
。

技术介绍

[0002]成人多囊肾病
(polycystic kidney disease, PKD)
是一种常见的遗传性肾脏疾病，大多数为常染色体显性遗传
。
患者多在成年后发病，发病率估计为
1/400~1/1000。
常染色体显性遗传性多囊肾病
(autosomal dominant polycystic kidney disease, ADPKD)
是最常见的遗传性肾脏病，遗传学研究表明该病的发生主要由于蛋白激酶
D1(PKD1)
或蛋白激酶
D2(PKD2)
突变引起的，其中
PKD1
为Ⅰ型多囊肾病，占据约
80%~85%
的病例；
PKD2
为Ⅱ型多囊肾病，占据约
10%~15%
的病例
。ADPKD
的特点是在任何年龄均可发病，多发于
30~50
岁，具有常染色体显性遗传特征，代代发病，基因缺陷引起的临床异常除了累积肾脏外，还伴有肝囊肿
、
胰腺囊肿
、
卵巢囊肿
、
血管系统及心脏瓣膜结构的畸形等症状
。
全球约
1200
>万患者深受该疾病的影响，约有
50%
患者会发展到终未期肾功能衰竭，需要通过异源肾脏移植或者终身血液透析治疗维持生命
。
而在我国大约有
150
万人群饱受此疾病折磨
。ADPKD
不仅给患者造成严重的身体和精神上的折磨，同时给患者家庭带来沉重的经济负担
。
因此，对患者进行基因检测能够明确疾病发生的原因，预后判断直系亲属，提供产前诊断结果，为生育健康婴儿加强一份保障
。
[0003]PKD1
基因定位于人类染色体第
16
号染色体短臂1区3带3亚带 (16p13.3)
，基因全长约
47kb
，共有
46
个外显子，编码
4302
个氨基酸残基组成的跨膜糖蛋白
——
多囊蛋白
1(polycystin 1, PC1)。PKD1
基因在
16
号染色体上存在着与其同源的6个假基因，假基因与其基因的
1~33
号外显子序列同源性高达
97.7%
，据报道，大约
80%
的致病突变发生在此区域，并且在此区域内有部分
DNA
序列
GC
含量高达
85%
，导致基因扩增存在一定的难度，对突变位点的验证也较为困难
。
除此之外，
PKD1
基因突变类型较多，且无突变热点，涉及到整个基因，因此针对
PKD1
基因的特异性检测极具挑战
。
[0004]由于
PKD1
基因本身的结果特点以及突变类型，随着新技术的不断发展，
PKD1
基因的检测方法也在不断革新
。
目前检测
PKD1
的方法有
LR
‑
PCR、
变性高效液相色谱
、LR
‑
PCR
联合高通量测序
、
外显子捕获
‑
高通量测序方法等
。
变性高效液相色谱技术用于
PKD1
基因突变筛查方法，虽然在一定程度上能够提高突变检测率，但是检测结果存在不稳定性以及结果的准确性也有待提高
。
目前较为经典的检测
PKD1
基因突变的方法为巢式
PCR
‑
Sanger
测序，该方法需要先将目的基因通过
LR
‑
PCR
进行扩增后，再针对突变位点再次进行靶向扩增测序后分析结果，该技术耗费人力较大，成本高昂且效率低下
。
张树忠等人联合采用
LR
‑
PCR
和巢式
PCR
扩增的方法扩增
PKD1
全编码区来确定突变的具体位点和类型，研究中用到的引物高达几十组，虽然结果较为准确，但是操作十分繁琐，需要结合变性高效液相色谱技术，检测成本较高且检测效率有待提升
。
此外
TW201339309A
公开了一种检测
PKD1
基因突变的引物组和试剂盒，其与张树忠等人的研究类似，也存在同样的问题
。
萧畔等人通过
PCR
特异性扩增
PKD1
基因的
12、14、21
外显子片段，检测区域有限，不具备检测
PKD1
整个基因区域的变异，具有一定的局限性
。CN104531883A
公开了一种检测
PKD1
基因突变的试剂盒和检测方法，通过
5~8
对长片段扩增子扩增
PKD1
基因
2~46
号外显子进行扩增，随后采用
NGS
的方法进行检测，虽然该方法能够快速高效地检测样本，但是由于该技术方法具有
GC
偏好性，对于
PKD1
基因高
GC
区域检测仍然具有缺陷
。

技术实现思路

[0005]本专利技术所要解决的技术问题是克服
技术介绍
的技术缺陷，提供一种用于
PKD1
基因突变检测的引物组
、
试剂盒及检测方法
。
本专利技术通过设计一组引物，成功扩增整个
PKD1
基因，建库过程不需要再进行
PCR
扩增，利用三代测序技术成功构建
PKD1
基因单体型以及检测
PKD1
基因内突变，携带者单体型构建过程无需其他家系样本；本专利技术检测结果能够媲美样本进行
WGS
测序，大大降低了检测成本和检测周期，更加适用于临床检测服务
。
[0006]本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案如下：一种用于
PKD1
基因突变检测的引物组，所述引物组包括6对引物，用于扩增
PKD1
基因整个区域，每对引物的扩增产物之间均有
10kb
以上的重叠区域；所述6对引物的序列如下（
hg19
参考基因组）：用于扩增
PKD1
基因
chr16
：
2130793...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种用于
PKD1
基因突变检测的引物组，其特征在于，所述引物组包括6对引物，所述6对引物的序列如下：用于扩增
PKD1
基因
chr16
：
2130793
‑
2144241
的引物，其正向引物序列如
SEQ ID NO:1
所示，反向引物序列如
SEQ ID NO:2
所示；用于扩增
PKD1
基因
chr16
：
2134219
‑
2154799
的引物，其正向引物序列
SEQ ID NO:3
所示，反向引物序列如
SEQ ID NO:4
所示；用于扩增
PKD1
基因
chr16
：
2144661
‑
2166375
的引物，其正向引物序列
SEQ ID NO:5
所示，反向引物序列如
SEQ ID NO:6
所示；用于扩增
PKD1
基因
chr16
：
2151918
‑
2173659
的引物，其正向引物序列
SEQ ID NO:7
所示，反向引物序列如
SEQ ID NO:8
所示；用于扩增
PKD1
基因
chr16
：
2158065
‑
2178648
的引物，其正向引物序列
SEQ ID NO:9
所示，反向引物序列如
SEQ ID NO:10
所示；用于扩增
PKD1
基因
chr16
：
2171520
‑
21918496
的引物，其正向引物序列
SEQ ID NO:11
所示，反向引物序列如
SEQ ID NO:12
所示
。2.
如权利要求1所述的一种用于
PKD1
基因突变检测的引物组，其特征在于，所述引物组用于扩增
PKD1
基因整个区域及其上下游共约
15kb
范围
。3.
一种用于
PKD1
基因突变检测的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的用于
PKD1
基因突变检测的引物组
。4.
如权利要求3所述的一种用于
PKD1
基因突变检测的试剂盒，其特征在于，所述引物组中的每个引物的浓度为
10
μ
M。5.
如权利要求3所述的一种用于
PKD1
基因突变检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于扩增
PKD1
基因长片段序列的
PCR
反应试剂
、
和
/
或用于从样本中提取基因组
DNA
的试剂及处理后的
PCR
产物用于三代
Nanopore
测序的试剂
。6.
如权利要求5所述的一种用于
PKD1
基因突变检测的试剂盒，其特征在于，所述用于扩增
PKD1
基因长片段序列的
PCR
反应试剂包括2×
Phanta Flash Master Mix
，其包括
DNA
聚合...

【专利技术属性】
技术研发人员：王姣姣，冯韶华，费嘉，樊海洋，汤曼，
申请(专利权)人：北京嘉宝仁和医疗科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：