一种非组培依赖的萝卜原位遗传转化方法技术

本发明专利技术提供了一种萝卜原位转化方法，包括以下步骤：对萝卜种子催芽播种至两叶一心时期，获得转化受体；活化携带目的基因的根癌农杆菌菌液并制备侵染液；切除幼苗的顶端，仅保留一片子叶，形成伤口，并用菌液注射伤口部位；对伤口部位包裹处理并共培养

【技术实现步骤摘要】
一种非组培依赖的萝卜原位遗传转化方法


[0001]本专利技术属于萝卜转基因体系
，具体涉及一种非组培依赖的萝卜原位遗传转化方法的萝卜原位转化方法
。

技术介绍

[0002]萝卜
(Raphanus sativus L.)
为十字花科萝卜属一
、
二年生根菜类作物，具有较高的营养和食疗保健价值
。
目前，萝卜新品种培育主要以传统育种方式为主，但由于这种方式周期长，难以满足如今品种更新的要求，而以基因工程技术为代表的新兴生物技术的快速发展与成功应用，为萝卜育种开辟了一条新的途径
。
[0003]萝卜是再生顽拗型植物，几十年来，研究学者尝试利用常规的组织培养技术进行基因转化，以期能提高萝卜再生和遗传转化效率
。
然而，至今在萝卜中尚未能建立起高效
、
稳定的遗传转化体系，严重限制了萝卜遗传转化的研究，阻碍了萝卜种质资源创新进程
。
目前，已有多种作物利用原位转化技术成功生产转基因植株，相对于常规的依赖组织培养的遗传转化技术，原位转化操作更简单，周期更短，且较少受基因型的限制，再生顽拗作物也能获得较高转化效率
。
但是非组培依赖的萝卜原位遗传转化方法未见报道
。
因此，如何采用简单
、
快捷的原位转化法，提高萝卜的转化率，成功实现某些特定品种的转化，是本领域技术人员亟需解决的问题
。

技术实现思路

[0004]为解决现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种非组培依赖的萝卜原位遗传转化方法，转化全程无需组织培养，诱导分生组织再生，该方法可简便高效地获得转基因萝卜植株，为萝卜分子育种
、
目的基因功能解析和优异种质创新提供有力技术支持
。
[0005]为了解决上述技术问题，本专利技术所采用的技术方案如下：
[0006]一种非组培依赖的萝卜原位遗传转化方法，包括以下步骤：
[0007](1)
侵染材料准备：对萝卜种子进行催芽，将催芽后的种子播种到基质中获得萝卜幼苗；
[0008](2)
活化携带目的基因的根癌农杆菌菌液；
[0009](3)
侵染液制备：侵染的前一天刮取少量活化菌液，置于
LB
液体培养基摇菌进行扩繁，并制备侵染液；
[0010](4)
萝卜幼苗预处理与侵染；
[0011](5)
共培养与转基因植株筛选；
[0012](6)
转基因叶片
DNA
提取和
PCR
检测
。
[0013]进一步地，步骤
(1)
中，催芽过程于垫有湿润定性滤纸的培养皿中进行，具体如下：采用湿润定性滤纸和培养皿进行催芽，将种子清洗后均匀撒播在滤纸上，在室温黑暗条件下催芽为
24h
至种子露白后播种于装有基质土的穴盘中生长
10
‑
14d
，生长过程中保持基质内部湿润
。
该材料准备过程无需组织培养
。
[0014]进一步地，携带目的基因的根癌农杆菌菌液保存在
‑
80℃
冰箱中，并采用
LB
固体培养基活化农杆菌，
[0015]其中，所述的根癌农杆菌为
GV1301
菌株，所述
LB
固体培养基为：在每升
LB
培养基中添加
100mg/L
卡那霉素
(Kanamycin
，
Kan)+60mg/L
利福平
(Rifampicin
，
Rif)+15g/L
琼脂，此活化过程在侵染前
2d
进行
。
[0016]进一步地，步骤
(3)
中，所述
LB
液体培养基为
100mg/L Kan+60mg/L Rif
；
[0017]侵染液制备前，离心的菌体应用
1/2MS
液体培养基清洗两次；使用
1/2MS
液体培养基重悬菌体，调节
OD
600
值为
0.6
，加入
100
μ
M AS
和
10mM MgCl2，在
28℃
恒温培养箱中静置
4h
后获得侵染液；
1/2MS
液体培养基的成分为
4.6g/L 1/2MS+30g/L
蔗糖
。
[0018]进一步地，步骤
(4)
中取两叶一心时期的萝卜幼苗，使用消毒的手术刀片，逆着子叶生长方向，紧贴一边子叶
45
°
向下快速切除幼苗的顶端，仅保留一片较为健壮的子叶，然后使用石蜡封口膜在切口下方以漏斗状围绕，吸取根癌农杆菌菌液并注入漏斗中，于
28℃
黑暗环境下侵染
1h。
[0019]进一步地，步骤
(5)
中侵染结束后，除去盛有菌液的封口膜，立即用湿润的脱脂棉进行包裹防止伤口失水，最外层用保鲜膜包裹，置于
28℃
黑暗环境中共培养
2d。2d
后将
40mg/L Kan
溶液注射到切口表面脱脂棉处
。
[0020]进一步地，提取
DNA
的方法为
CTAB
法；
DNA
检测的
PCR
反应体系如下：总体积为
10
μ
L
，其中
Taq
酶
Mix 5
μ
L、
引物
F/R(10
μ
M)
各
0.5
μ
L、
模板
DNA(20ng/
μ
L)1
μ
L、ddH2O 3
μ
L。
[0021]PCR
反应程序：
[0022][0023][0024]有益效果：与现有技术相比，本专利技术的优点在于：
[0025](1)
本专利技术首次建立了一种萝卜原位转化方法
[0026](2)
操作简单快捷，技术门槛低，转化周期短
。
[0027](3)
提高了萝卜的遗传转化率，克服了萝卜目前的转化障碍，获得了稳定
、
高效的根癌农杆菌介导的遗传转化方法
。
附图说明
[0028]图1是本专利技术实例1的转基因植株的
PCR
分析结果
(
泳道1‑
12
：转基因植株；泳道
p
：阳性对照；泳道
CK
：阴性对照；<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种非组培依赖的萝卜原位遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)
侵染材料准备：对萝卜种子进行催芽，将催芽后的种子播种到基质中获得萝卜幼苗；
(2)
活化携带目的基因的根癌农杆菌菌液；
(3)
侵染液制备：侵染的前一天刮取少量活化菌液，置于
LB
液体培养基摇菌进行扩繁，并制备侵染液；
(4)
萝卜幼苗预处理与侵染；
(5)
共培养与转基因植株筛选；
(6)
转基因叶片
DNA
提取和
PCR
检测
。2.
如权利要求1所述的一种非组培依赖的萝卜原位遗传转化方法，其特征在于：步骤
(1)
中，催芽过程于垫有湿润定性滤纸的培养皿中进行，具体如下：采用湿润定性滤纸和培养皿进行催芽，将种子清洗后均匀撒播在滤纸上，在室温黑暗条件下催芽
24h
；至种子露白后播种于装有基质土的穴盘中生长
10
‑
14d
，生长过程中保持基质内部湿润
。3.
如权利要求1所述的一种非组培依赖的萝卜原位遗传转化方法，其特征在于：步骤
(2)
中携带目的基因的根癌农杆菌菌液保存在
‑
80℃
冰箱中，并采用
LB
固体培养基活化农杆菌
。
其中，所述的根癌农杆菌为
GV1301
菌株，所述
LB
固体培养基为：在每升
LB
培养基中添加
100mg/L
卡那霉素
(Kanamycin
，
Kan)+60mg/L
利福平
(Rifampicin
，
Rif)+15g/L
琼脂，此活化过程在侵染前
2d
进行
。4.
如权利要求1所述的一种非组培依赖的萝卜原位遗传转化方法，其特征在于：步骤
(3)
中，所述
LB
液体培养基为
100mg/L Kan+60mg/L Rif
；侵染液制备前，离心的菌体应用
1/2MS
液体培养基清洗两次；使用<...

【专利技术属性】
技术研发人员：王燕，柳李旺，胡秋艳，姚数琦，秦跳姣，易小芳，李冰霜，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：