一种成软骨仿生半月板及其制备方法技术

本发明专利技术提供了一种成软骨仿生半月板及其制备方法，制备方法包括以下步骤：获取个体的膝关节影像数据，根据膝关节影像数据构建半月板模型，根据半月板模型进行3D打印得到仿生半月板；制备重悬种子细胞溶液；将0.5mL制备重悬种子细胞溶液均匀滴入孔板中的仿生半月板上，CO2培养箱中静置培养3小时后加入10％胎牛血清的α

【技术实现步骤摘要】
一种成软骨仿生半月板及其制备方法


[0001]本专利技术涉及生物医学组织工程
，具体地，涉及一种成软骨仿生半月板及其制备方法。

技术介绍

[0002]组织工程(Tissue Engineering，TE)概念在1993年被Langer和Vacanti首先提出。经过20多年的发展，组织工程(TE)技术已经广泛地应用于骨组织、软骨、神经、血管、皮肤等组织器官的再生和修复，随着对半月板在膝关节生物力学中的重要作用的认识不断深入，利用组织工程技术进行半月板的修复再生为半月板损伤患者的治疗带来了新的希望，组织工程主要包含三个要素：支架、细胞和生长因子，与传统支架制造技术相比，3D打印技术具有良好的重复性和对支架微观结构和形状的控制。
[0003]目前，组织工程化半月板的支架大致可分为四大类别：组织衍生支架、细胞外基质成分支架、合成聚合物支架和水凝胶支架等。组织衍生支架的缺点是机械性能不足和组织来源有限；药效研究发现细胞外基质组分支架出现收缩和胶原重塑，这可能会影响其机械性能，此外预防膝关节骨性关节炎的植入物(细胞外基质组分支架)正功效临床研究相对较少，目前尚未明确；水凝胶支架生物活性相对较好，但其力学性能差；合成聚合物支架具有容性好、降解速度慢、力学性能相对较好的优点，但单独的聚合物材料移植的治疗效率较为缓慢，结合具有生物活性的间充质干细胞或软骨细胞可以加快损伤的恢复，且恢复到接近损伤前状态的潜力更大。
[0004]此外，目前还有一种通过添加有细胞的3D打印墨水进行3D打印获得的有生物活性的仿生半月板，通过这种方法获得的仿生半月板的具体细胞状态和活性目前还难以保证。

技术实现思路

[0005]针对现有技术中的缺陷，本专利技术的目的是提供成软骨仿生半月板及其制备方法，本专利技术实施例提供的成软骨仿生半月板制备方法中，细胞与3D打印聚己内酯(PCL)仿生半月板结合程度高且增殖活性高，获得了结合稳固且具有高增殖活性的成软骨仿生半月板；此外，本专利技术还提供了一种成软骨仿生半月板。
[0006]本专利技术第一方面提供了一种成软骨仿生半月板的制备方法，包括以下步骤：
[0007]获取个体的膝关节影像数据，根据膝关节影像数据构建半月板模型，根据半月板模型进行3D打印得到仿生半月板；
[0008]制备重悬种子细胞溶液，所述的重悬种子细胞溶液中的种子细胞为干细胞，所述的重悬种子细胞溶液的浓度为5
×
106～2
×
107cells/mL；
[0009]仿生半月板消毒后置于12孔板中，将0.5mL重悬种子细胞溶液均匀滴入12孔板中的仿生半月板上，CO2培养箱中静置培养3小时后加入10％胎牛血清的α
‑
MEM3mL，继续在CO2培养箱中培养48小时，然后放入6孔板中培养，每48小时换液一次，加入5mLα
‑
MEM完全培养基，从重悬种子细胞溶液均匀滴入12孔板中的仿生半月板的当天开始算起，共培养1～14
天；
[0010]培养1～14天后将仿生半月板置于另一6孔板中，加入成软骨分化试剂，诱导培养14天，得到成软骨仿生半月板。
[0011]在本专利技术的一实施方式中，所述的重悬种子细胞溶液浓度为2
×
107cells/mL或1
×
107cells/mL或5
×
106cells/mL。
[0012]在本专利技术的一实施方式中，制备重悬种子细胞溶液具体包括以下步骤：取生长良好的种子细胞，用完全培养基培养，待细胞长至80％
‑
90％汇合后，加入消化酶消化1min，加入完全培养基终止消化反应，将细胞悬液收集至离心管中，离心收集细胞，离心后弃上清培养基，加入适量的完全培养基调整重悬种子细胞溶液浓度。
[0013]在本专利技术的一实施方式中，所述种子细胞为骨髓间充质干细胞或脂肪间充质干细胞或滑膜间充质干细胞或人脐带间充质干细胞。
[0014]在本专利技术的一实施方式中，所述种子细胞为人脐带间充质干细胞；
[0015]生长良好的人脐带间充质干细胞通过以下步骤获得：选用第3代人脐带间充质干细胞，将第3代人脐带间充质干细胞从液氮罐中取出，迅速放入37℃恒温水浴锅中，轻轻地不断轻晃，待其融化，无菌条件下迅速将冻存管里的细胞转移到含有完全培养基的离心管中，充分混匀，离心，弃掉上清液，加入适量的完全培养基充分吹打混匀，装于细胞培养瓶中，置于37℃、5％CO2细胞培养箱内静置培养，24h后，更换一次培养液继续培养，此后每3天换液1次；显微镜下观察细胞的生长和形态变化，待细胞长至80％
‑
90％汇合后进行传代培养操作，取生长良好的人脐带间充质干细胞(UCMSC)进行种子细胞悬液的制备。
[0016]在本专利技术的一实施方式中，制备重悬种子细胞溶液的步骤中，所述的完全培养基为10％胎牛血清的α
‑
MEM。
[0017]在本专利技术的一实施方式中，所述的消化酶为Tryple。
[0018]在本专利技术的一实施方式中，制备重悬种子细胞溶液的步骤中，离心收集细胞时离心参数为：200g条件下离心3～5分钟。
[0019]在本专利技术的一实施方式中，仿生半月板的消毒包括以下步骤：紫外照射20～30分钟，75％酒精浸泡10～30分钟，酒精消毒后用0.9％NaCl溶液漂洗3遍，最后用α
‑
MEM完全培养基润洗3遍。
[0020]在本专利技术的一实施方式中，所述的个体为雄性、4月龄新西兰兔。
[0021]本专利技术第二方面提供了一种采用上述制备方法得到的成软骨仿生半月板。
[0022]与现有技术相比，本专利技术的实施例具有如下的有益效果：
[0023]1、本专利技术实施例提供的成软骨仿生半月板制备方法中，细胞与3D打印PCL仿生半月板结合程度高且增殖活性高，获得了结合稳固且具有高增殖活性的成软骨仿生半月板。
[0024]2、本专利技术实施例提供的成软骨仿生半月板制备方法中，未使用胶原等粘和剂，尽可能地减少了异源物质。
[0025]3、本专利技术实施例提供的成软骨仿生半月板的制备方法中，种子细胞由脐带间充质干细胞(UCMSC)诱导而来，很好的解决了天然成软骨细胞资源不足这一问题。
[0026]4、本专利技术实施例提供的成软骨仿生半月板制备方法制备所得成软骨半月板，可以用来进行体内半月板移植实验。
[0027]当然，实施本专利技术的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。
附图说明
[0028]通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本专利技术的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
[0029]图1为实施例1
‑
3中的仿生半月板细胞接种第1天、第5天、第8天、第11天、第14天显微镜镜检结果(200X)，图1中箭头所指为UCMSC仿生半月板形成的细胞膜；
[0030]图2为实施例1
‑
3中的仿生半月板细胞接种第11天扫描本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种成软骨仿生半月板的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：获取个体的膝关节影像数据，根据膝关节影像数据构建半月板模型，根据半月板模型进行3D打印得到仿生半月板；制备重悬种子细胞溶液，所述的重悬种子细胞溶液中的种子细胞为干细胞，所述的重悬种子细胞溶液的浓度为5
×
106～2
×
107cells/mL；仿生半月板消毒后置于12孔板中，将0.5mL重悬种子细胞溶液均匀滴入12孔板中的仿生半月板上，CO2培养箱中静置培养3小时后加入10％胎牛血清的α
‑
MEM 3mL，继续在CO2培养箱中培养48小时，然后放入6孔板中培养，每48小时换液一次，加入5mLα
‑
MEM完全培养基，从重悬种子细胞溶液均匀滴入12孔板中的仿生半月板的当天开始算起，共培养1～14天；培养1～14天后将仿生半月板置于另一6孔板中，加入成软骨分化试剂，诱导培养14天，得到成软骨仿生半月板。2.根据权利要求1所述的成软骨仿生半月板的制备方法，其特征在于，所述的重悬种子细胞溶液浓度为2
×
107cells/mL或1
×
107cells/mL或5
×
106cells/mL。3.根据权利要求2所述的成软骨仿生半月板的制备方法，其特征在于，仿生半月板消毒后置于12孔板中，将0.5mL重悬种子细胞溶液均匀滴入12孔板中的仿生半月板上，CO2培养箱中静置培养3小时后加入10％胎牛血清的α
‑
MEM 3mL，继续在CO2培养箱中培养48小时，然后放入6孔板中培养，每48小时换液一次，加入5mLα
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MEM完全培养基，从重悬种子细胞溶液均匀滴入12孔板中的仿生半月板的当天开始算起，共培养11天。4.根据权利要求2所述的成软骨仿生半月板的制备方法，其特征在于，制备重悬种子细胞溶液具体包括以下步骤：取生长良好的种子细胞，用完全培养基培养，待细胞长至80％
‑
90％汇合后，加入消化酶消化1min，加入完全培养基终止消化反应，将细胞悬液收集...

【专利技术属性】
技术研发人员：齐念民，王皓，吕乾，谢凡，王宏伟，
申请(专利权)人：浙江泉生生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：