一种基于制造技术

本发明专利技术公开了一种基于

【技术实现步骤摘要】
一种基于HNB指示剂的西瓜枯萎病菌的LAMP检测技术


[0001]本专利技术涉及西瓜枯萎病菌分子检测
，更具体地说，它涉及一种基于
HNB
指示剂的西瓜枯萎病菌的
LAMP
检测技术
。

技术介绍

[0002]西瓜是一年生葫芦科蔓性草本植物，作为一种重要的经济作物，在世界范围内广泛种植
。
中国是世界上最大的西瓜产地与消费国，西瓜的播种面积超过
3000
亩
。
[0003]西瓜甘甜多汁，清爽解渴，富含丰富的维生素
C
等物质，营养价值高，具有重要的经济价值，但由尖孢镰刀菌引起的西瓜枯萎病成为目前危害西瓜生产最重要的病害之一
。
近年来西瓜枯萎病每年造成
30
％
‑
50
％的产量损失，严重时可造成
85
％以上的损失
。
该病害在西瓜生长的各个时期均可发生危害
。
病残体和带菌土壤在条件适宜时其分生孢子和厚垣孢子萌发产生侵入丝从植株根部伤口或根毛顶端细胞间侵入植株，侵入后菌丝在表皮细胞间扩展蔓延，逐渐占据并堵塞维管束，影响水分运输，导致植株缺水萎蔫，最终死亡
。
目前缺乏抗性品种和特效药，对西瓜枯萎病的病后治理难度大
。
现阶段常用的防治手段主要有：培育抗性品种
、
轮作换茬
、
嫁接和药剂防治等
。
但由于土地资源有限，轮作不易实行；嫁接成本高，难度大；药剂防治易污染环境，且缺乏特效药
。
因此，在西瓜未显症时对其进行定性检测对防治西瓜枯萎病有重要意义
。
[0004]传统的镰刀菌鉴定方法是通过病原菌分离，根据形态学差异进行判断，这要求实验人员具有丰富的专业知识和经验，且鉴定周期长，准确性不高
。20
世纪
80
年代
PCR
技术的出现，使得可以从分子方面对西瓜枯萎病菌进行检测鉴定，缩短了鉴定周期
。
近年来，随着分子检测手段的高速发展，国内外学者不断报道有关西瓜枯萎病菌的分子检测方法
。
曹月霞通过将
FON
的通用引物
W106S
和
W106R
结合，建立了
FON
的双重
PCR
检测方法；肖姬玲等建立了
FON
的
SYBR Green I qPCR
体系；
2005
年，
zhang
等根据
FON
的
ITS
序列设计特异性引物并建立
PCR
体系等，但由于该技术需要昂贵的实验仪器无法在田间进行实际操作
。2000
年
Notomi
专利技术了
LAMP
技术，该技术针对靶基因序列的6个不同区域设计4种特异性引物，通过一种具有链置换活性的
Bst DNA
聚合酶，在
65℃
恒温反应
1h
即可产生爆发式扩增
。
试验过程中发现，通过加入两条环引物
LF/LB
可加速反应
。
[0005]羟基萘酚蓝
(hydroxynaphtholblue
，
HNB)
是一种金属离子指示剂，可与反应体系中的
Mg
2+
结合形成紫罗兰色
(
阴性
)。
随着反应的进行，体系产成焦磷酸镁沉淀，失去镁离子的
HNB
呈现天蓝色
(
阳性
)。
该技术不需要使用
PCR
仪，反应灵敏快速，使得
LAMP
技术在病原菌检测上得到广泛应用
。
稻瘟病菌和灰霉病菌的
LMAP
检测技术都有报道，针对西瓜枯萎病的
LAMP
检测技术鲜少报道
。

技术实现思路

[0006]针对现有技术存在的不足，本专利技术的目的在于提供一种基于
HNB
指示剂的西瓜枯萎病菌的
LAMP
检测技术
。
[0007]本专利技术的目的可以通过以下技术方案实现：
[0008]一种基于
HNB
指示剂的西瓜枯萎病菌的
LAMP
检测技术，包括如下步骤：
[0009]步骤一：提取西瓜枯萎病菌基因组
DNA
及试验所需真菌基因组
DNA
；
[0010]步骤二：利用
SeqHunter2
软件对所选病原真菌进行基因序列比对初步筛选
FON
的特异性片段，再将比对得到的特异性片段利用
NCBI
网站进行比对验证，最终得到4个
FON
的特异性片段，4个特异性片段的基因标号分别为
NW_022158653.1
，
NW_022158654.1
，
NW_022158672.1
，
NW_022158681.1
；
[0011]步骤三：利用
PrimerExplorerV4
网站进行
LAMP
引物的设计；
[0012]步骤四：对所设计的
LAMP
引物进行灵敏度和特异性筛选，最终得到一组灵敏度和特异性强的引物；
[0013]步骤五：针对步骤四中灵敏度和特异性强的引物对设计环引物
LF/LB
，对筛选得到的环引物进行筛选鉴定，观察环引物
LF/LB
对反应速度的影响
。
[0014]进一步的，所述的
LAMP
引物是以西瓜枯萎病菌的特异性
DNA
片段为靶标，利用在线网站设计
。
[0015]进一步的，所述的
NW_022158653.1
的部分特异性片段序列如下：
[0016]ACAGGGTTATTAATAATATATGGATTATCAATGTGCTTTAAGTACTTAAAGGAAGAGAAACCTGCGTTCTGCCCAACTATTACTCTATCGCCGGAAGTGAAGTTTTAATCCTAAGCGACGAACATATTTTACCTCACAAAGAGAAACACTTCTCCTTGCCGCACGTCTGGTCCGTTGGTTAGACGGTAGATACGACCCAATTCAGAAAATATCGGAAAGACTCATTAGTTGTCTCCGCAACGCCTGAACTTCAATACCCTAACTTCTCGT。
[0017]进一步的，所述的西瓜枯萎病菌为尖孢镰刀菌西瓜专化型
。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种基于
HNB
指示剂的西瓜枯萎病菌的
LAMP
检测技术，其特征在于，包括如下步骤：步骤一：提取西瓜枯萎病菌基因组
DNA
及试验所需真菌基因组
DNA
；步骤二：利用
SeqHunter2
软件对所选病原真菌进行基因序列比对初步筛选
FON
的特异性片段，再将比对得到的特异性片段利用
NCBI
网站进行比对验证，最终得到4个
FON
的特异性片段，4个特异性片段的基因标号分别为
NW_022158653.1
，
NW_022158654.1
，
NW_022158672.1
，
NW_022158681.1
；步骤三：利用
PrimerExplorerV4
网站进行
LAMP
引物的设计；步骤四：对所设计的
LAMP
引物进行灵敏度和特异性筛选，最终得到一组灵敏度和特异性强的引物；步骤五：针对步骤四中灵敏度和特异性强的引物对设计环引物
LF/LB
，对得到的环引物进行筛选鉴定，观察环引物
LF/LB
对反应速度的影响
。2.
根据权利要求1所述的一种基于
HNB
指示剂的西瓜枯萎病菌的
LAMP
检测技术，其特征在于，所述的
LAMP
引物是以西瓜枯萎病的特异性
DNA
片段为靶标，利用在线网站设计
。3.
根据权利要求1所述的一种基于
HNB
指示剂的西瓜枯萎病菌的
LAMP
检测技术，其特征在于，所述的
NW_022158653.1
的部分特异性片段序列如下：
ACAGGGTTATTAATAATATATGGATTATCAATGTGCTTTAAGTACTTAAAGGAAGAGAAACCTGCGTTCTGCCCAACTATTACTCTATCGCCGGAAGTGAAGTTTTAATCCTAAGCGACGAACATATTTTACCTCACAAAGAGAAACACTTCTCCTTGCCGCACGTCTGGTCCGTTGGTTAGACGGTAGAT...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋春号，董文盼，许配玲，杨纪潇，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：