提取海洋鱼脑或皮肤色素细胞组织细胞核的方法技术

本发明专利技术涉及一种提取海洋鱼脑或皮肤色素细胞组织细胞核的方法，属于细胞核提取技术领域

【技术实现步骤摘要】
提取海洋鱼脑或皮肤色素细胞组织细胞核的方法


[0001]本专利技术涉及一种提取海洋鱼脑或皮肤色素细胞组织细胞核的方法，属于细胞核提取

。

技术介绍

[0002]CUT&RUN
（
cleavage under targets and release using nuclease
），即核酸酶靶向切割与释放技术，是一项用于在细胞天然染色质环境下分离蛋白
‑
DNA
复合体的新方法
。CUT&Tag
（
cleavage under targets and tagmentation
），即靶向剪切与转座酶技术，是一种利用酶锚定技术进行高效
、
高分辨的
DNA
测序文库构建方法，适用于蛋白质
‑
DNA
互作研究
。
与传统染色质免疫沉淀（
ChIP
）方法相比，
CUT&RUN
及
CUT&Tag
技术提供了一种新的研究方法，使蛋白质
‑
DNA
相互作用研究工作流程更加简单方便，且实验方案所需的材料很少，一般不超过
500,000
个细胞或细胞核
。
在该技术中，细胞核的提取非常关键，需要充分裂解细胞膜释放细胞核，且尽可能保证核膜完整
、
离散，减少杂质和结团率，从而获得适用于组织
CUT&Tag
文库构建的细胞核，使得在动物组织层面执行
CUT&Tag
技术成为可能，在表观技术研究领域具有较大的应用优势和较高的商业价值
。
[0003]目前，从动物组织中提取大量完好细胞核仍比较困难，所以
CUT&Tag
技术在动物组织样本中的使用方法并不是十分广泛
。
特别是对于对鱼类动物组织的细胞核提取，其方法更少，严重制约了表观遗传学研究的发展
。

技术实现思路

[0004]本专利技术所要解决的技术问题提供一种提取海洋鱼脑或皮肤色素细胞组织细胞核的方法
。
[0005]本专利技术提取海洋鱼脑或皮肤色素细胞组织细胞核的方法，包括如下步骤：
a、
组织裂解及细胞核释放：取海洋鱼的组织，加入
NE buffer
溶液后，捣碎匀浆，然后过细胞筛，所得溶液进行离心；
b、
细胞核洗涤：
a
步骤离心后的产物去除上清液，用
Wash buffer 溶液洗涤沉淀，离心分离，得到细胞核；控制
a
和
b
步骤的温度
≤4℃
；所述组织为脑组织或皮肤色素细胞组织；控制
a
步骤从加入
NE buffer
溶液到过细胞筛完成的时间，脑组织：
10
±
1 min
；皮肤色素细胞组织：8±
1 min
；所述的
NE buffer
溶液为：以
50 mL NE buffer
溶液计，包含：
1 mL 1M HEPES
‑
KOH 缓冲液
pH 7.9
，
500 μ
L 1M KCl
溶液，
12.5 μ
L 2 M 亚精胺溶液，
500
ꢀµ
L 10% Triton X
‑
100
，
10 mL 甘油，用
dH2O
定容至
50 mL
，加入1片不含
EDTA
的
cOmplete
™
蛋白酶抑制剂混合物；所述
Wash buffer
溶液为：以
50 mL Wash buffer
溶液计，包含：
1 mL 1 M HEPES
溶液
pH 7.5
，
1.5 mL 5 M NaCl
溶液，
12.5 μ
L 2 M 亚精胺溶液，
833 μ
L 6% 牛血清蛋白溶液，用
dH2O
定容至
50 mL
，加入1片不含
EDTA
的
cOmplete
™
蛋白酶抑制剂混合物
。
[0006]在本专利技术的一个具体实施方式中，提取海洋鱼脑或皮肤色素细胞组织细胞核的方法，还包括以下步骤：
c、
细胞核重悬：
b
步骤离心后的产物除去上清液，用
Wash buffer
溶液重悬沉淀，得到目标数量海洋鱼组织细胞核溶液
。
[0007]在一个具体实施方式中，所述海洋鱼为豹纹鳃棘鲈或驼背鲈
。
[0008]在本专利技术一个具体实施例中，
a
步骤中的海洋鱼组织进行组织裂解前先用
PBS
溶液清洗
。
[0009]在本专利技术一个具体实施例中，
a
步骤中，捣碎前先将组织剪碎至大小至
≤1 mm。
[0010]在本专利技术一个具体实施例中，
a
步骤中，所述捣碎匀浆的操作为：在玻璃匀浆器中进行捣碎，使用玻璃匀浆器的
A
杵进行初始样品的降解，直至阻力消失，再使用
B
杵匀浆
。
[0011]在本专利技术一个具体实施例中，
a
步骤中，当组织为脑组织时，细胞筛的孔径为
40 μ
m
；当组织为皮肤色素细胞组织时，先过孔径
70 μ
m
细胞筛，再过孔径
40 μ
m
细胞筛
。
[0012]在本专利技术一个具体实施例中，
a
步骤中的离心条件为：
500
～
1500 xg
，
4 ℃
，
5 min
；优选
800 xg
，
4 ℃
，
5 min。
[0013]在本专利技术一个具体实施例中，
b
步骤中细胞核洗涤中所用
Wash buffer 溶液为
1 mL
，离心条件为：
650 xg
，
4℃
，
2 min
；洗涤次数为2～3次
。
[0014]与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：本专利技术方法，能够在较短时间内从海洋鱼类脑组织中成功分离提取大量较为纯净的完整的细胞核，且操作过程简单，无需特殊仪器设备，利用离心机及显微镜等常见实验室仪本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
提取海洋鱼脑或皮肤色素细胞组织细胞核的方法，其特征在于，包括如下步骤：
a、
组织裂解及细胞核释放：取海洋鱼的组织，加入
NE buffer
溶液后，捣碎匀浆，然后过细胞筛，所得溶液进行离心；所述海洋鱼为豹纹鳃棘鲈或驼背鲈；
b、
细胞核洗涤：
a
步骤离心后的产物去除上清液，用
Wash buffer 溶液洗涤沉淀，离心分离，得到细胞核；控制
a
和
b
步骤的温度
≤4℃
；所述组织为脑组织或皮肤色素细胞组织；控制
a
步骤从加入
NE buffer
溶液到过细胞筛完成的时间，脑组织：
10
±
1 min
；皮肤色素细胞组织：8±
1 min
；所述的
NE buffer
溶液为：以
50 mL NE buffer
溶液计，包含：
1 mL 1M HEPES
‑
KOH 缓冲液
pH 7.9
，
500 μ
L 1M KCl
溶液，
12.5 μ
L 2 M 亚精胺溶液，
500
ꢀµ
L 10% Triton X
‑
100
，
10 mL 甘油，用
dH2O
定容至
50 mL
，加入1片不含
EDTA
的
cOmplete
™
蛋白酶抑制剂混合物；所述
Wash buffer
溶液为：以
50 mL Wash buffer
溶液计，包含：
1 mL 1 M HEPES
溶液
pH 7.5
，
1.5 mL 5 M NaCl
溶液，
12.5 μ
L 2 M 亚精胺溶液，
833 μ
L 6% 牛血清蛋白溶液，用
dH2O
定容至
50 mL
，加入1片不含
EDTA...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶质，汪玉芬，包振民，胡景杰，栗昕，尹苗苗，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：