在外部使用特定分子装饰的人工蛋白质笼制造技术

本发明专利技术提供了一种人工

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】在外部使用特定分子装饰的人工蛋白质笼


[0001]本专利技术属于生物化学领域
。
涉及被称为“TRAP
笼”"
的人工蛋白质笼，其在外部使用特定分子
(
蛋白质
、
肽
、
小分子
、
核酸
)
装饰
。

技术介绍

[0002]组装成单分散笼状结构的蛋白质是用于生物技术和医学应用的有用的递送
/
展示载体
。
这种蛋白质笼存在于自然界中，例如病毒衣壳，但也可以在实验室中设计并构建
。
[0003]A.D.Malay
等：“Gold nanoparticle
‑
induced formation of an artificial protein capsids”；
Nano Letters,12(2012):2056
‑
2059(
将其通过援引并入本文
)
描述了使用与
TRAP
环配位的金原子稳定的
TRAP
笼，但是公开的
TRAP
笼在外部表面没有装饰
、
修饰或附加材料
。
[0004]因此，本专利技术人先前描述了来自嗜热脂肪土芽胞杆菌
(Geobacillus stearothermophilus)
的色氨酸
RNA
‑
结合减毒蛋白质的半胱氨酸修饰的变体
TRAPK35C R64S
可以通过与单价金离子反应组装成由多个环状十一聚体亚单位组成的中空球形结构
。
所得到的蛋白质笼在许多苛刻的条件下表现出极高的稳定性，但在含有巯基或膦的试剂存在下容易被分解为环亚基
。
[0005]基于这个吸引人的平台，开发一种通用的方法来修饰笼的外部，对于扩大人工蛋白质笼在药物递送和疫苗接种中的应用是至关重要的
。
[0006]本专利技术的目的是提供化学和酶促策略来装饰
TRAP
笼组件的外部表面
。

技术实现思路

[0007]本专利技术第一方面的专项是一种人工
TRAP
笼，其包括选定数目的
TRAP
环和多个与其连接，尤其是共价连接的外部装饰物
。
优选地，所述人工
TRAP
笼包括选定数量的
TRAP
环，这些
TRAP
环通过交联剂保持就位
。
优选地，所述交联剂是分子交联剂或原子金属交联剂
。
优选地，所述
TRAP
环通过金交联
。
[0008]优选地，所述外部装饰物选自包括以下的组：纳米抗体
、
抗体
、
表位
、
抗原
、
蛋白质
、
肽
、
细胞穿膜肽
、
抗原肽
、
多肽
、
核酸
、
信号分子
、
脂质
、
寡糖
、
染料分子
、
无机纳米颗粒
、
特异性配体和小分子治疗剂或其片段
。
[0009]所述外部装饰物也可以是抗体结合结构域
(
优选地，变体
Z15、Z34
和
Z34c
，它们均来源于蛋白
A、adhirons、SARS
‑
CoV
‑2刺突蛋白的抗
RBD
结构域
。
优选地，所述纳米抗体是荧光蛋白
(GFP)
‑
纳米抗体
(
开发的单链
V
H
H
抗体结构域，具有针对
GFP
的特异性结合活性
)
或纳米抗体
(Nbs)
，抗体的分离的结合部分
。
优选地，所述抗体是靶向细胞受体的抗体或靶向癌症调节蛋白诸如抗
‑
突变
p53
抗体的抗体
。
优选地，所述蛋白质或肽是受体结合分子
、
凝集素或转铁蛋白
、
转铁蛋白受体结合蛋白
。
它们可以是细胞因子，包括趋化因子干扰素，包括白介素
‑2及其人工形式的白介素，淋巴因子和肿瘤坏死因子
。
它们可以是荧光蛋白，优选
mCherry、TDtomato、Dtomato。
它可以是白蛋白优选地，所述肽是肽激素
、
细胞膜破坏肽
、T
细
Cysteines,Younggyu Kim,Sam O.Ho,Natalie R.Gassman,You Korlann,Elizabeth V.Landorf,Frank R.Collart,and Shimon Weiss,Bioconjugate Chemistry 2008 19(3),786
‑
791,
其通过援引并入本文
)。
[0025]优选地，所述生物缀合是通过叠氮化物
‑
反应性侧链进行的
。
优选地，所述叠氮化物
‑
反应性侧链是
DBCO。
[0026]优选地，所述附接是通过遗传偶联进行的，由此将遗传物质
(
例如，编码肽或蛋白质的
DNA
序列
)
添加在编码
TRAP
蛋白的
C
‑
末端区域的序列之后，结果是在遗传偶联的蛋白质被表达并纯化以及所述笼被组装后，由所述序列编码的肽或蛋白质位于
TRAP
笼的外部
。
[0027]优选地，所述遗传偶联是通过融合到
TRAP
的
C
末端
。
[0028]优选地，使用
SpyCatcher/SpyTag
缀合将外部装饰物优选地缀合到
TRAP
笼的外部表面
。
优选地，所述
Spycatcher/Spytag
将客体货物
(guest cargo)
缀合到
TRAP
笼的外部表面
。
优选地，当组装到
TRAP
笼中时，所述
SpyCatcher
被引入到面向外部的
TRAP
环区域
。
所述外部装饰物将包括
SpyTag。
所述
SpyTag
可以融合到
TRAP
蛋白的
C
末端
。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.
一种人工
TRAP
笼，包括选定数量的
TRAP
环和多个附接于其上的外部装饰物
。2.
根据权利要求1所述的笼，其中，所述外部装饰物选自包括以下的组：纳米抗体
、
抗体
、
表位
、
抗原
、
蛋白质
、
肽
、
细胞穿膜肽
、
抗原肽
、
多肽
、
核酸
、
信号分子
、
脂质
、
寡糖
、
染料分子
、
无机纳米颗粒
、
特异性配体和小分子治疗剂或其片段
。3.
根据权利要求1或2所述的笼，其中，所述外部装饰物是病毒抗原
、
微生物抗原或癌抗原
。4.
根据前述任一项所述的笼，其中，所述外部装饰物彼此相同或不同
。5.
根据前述权利要求中任一项所述的笼，其中，所述外部装饰物的至少一种包括细胞穿膜剂以促进所述笼的细胞内递送
。6.
根据权利要求5所述的笼，其中，所述细胞穿膜剂是
PTD4。7.
根据前述权利要求中任一项所述的笼，其中，所述
TRAP
笼的外部表面被通过以下中的一种或多种修饰以附接外部装饰物：
(i)
化学修饰；
(ii)
酶促偶联；
(iii)
生物缀合；
(iv)
遗传偶联；和
(v)
点击化学
。8.
根据前述权利要求中任一项所述的笼，其中，所述外部装饰物附接到
TRAP
笼的面向外部的半胱氨酸残基
。9.
根据前述权利要求中任一项所述的笼，其中，所述附接包括所述半胱氨酸残基的化学修饰，优选地，所述化学修饰是通过基于半胱氨酸
、
马来酰亚胺的缀合
。10.
根据前述权利要求中任一项所述的笼，其中，所述化学修饰包括基于赖氨酸酰胺的缀合
。11.
根据前述权利要求中任一项所述的笼，其中，所述附接包括酶促偶联，优选通过肽连接酶
。12.
根据权利要求
11
所述的笼，其中，所述肽连接酶是定位酶
、
天冬酰胺内切蛋白酶
、
胰蛋白酶相关酶或枯草杆菌蛋白酶衍生的变体
。13.
根据前述权利要求中任一项所述的笼，其中，所述附接包括生物缀合，优选用于附接表面巯基的马来酰亚胺标记的荧光染料
。14.
根据前述权利要求中任一项所述的笼，其中，所述生物缀合包括叠氮化物
‑
反应性侧链，优选地所述叠氮化物
‑
反应性侧链是
DBCO。15.
根据前述权利要求中任一项所述的笼，其中，所述遗传偶联包括与
TRAP
的
C
末端融合
。16.
根据前述权利要求中任一项所述的笼，其中，所述外部装饰物的
N
‑
末端序列融合到在所述
TRAP
笼外部可用的
TRAP
的
C
‑
末端序列
。17.
根据前述权利要求中任一项所述的笼，其中，所述外部装饰物使用
SpyCatcher/SpyTag
缀合来缀合
。18.
根据前述权利要求中任一项所述的笼，还包括封装在其中的内部货物
。19.
根据前述权利要求中任一项所述的笼，其中，所述
TRAP
笼中的
TRAP
环的数量在6至
60
之间
。20.
根据权利要求
19
所述的笼，其中，所述
TRAP
笼中的
TRAP
环的数量为
12、20
或
24
，优选为
24。21.
根据前述权利要求中任一项所述的笼，其中，所述
TRAP
环通过交联剂保持就位，所述交联剂包括一个或多个可编程的交联剂
。22.
根据前述权利要求中任一项所述的笼，其中，所述人工
TRAP
笼蛋白被修饰以包括选自包括以下的组的任意一个或多个突变：
K35C、K35H、R64S、K35C/R64S、K35H/R64S、S33C、S33H、S33C/R64S、S33H/R64S、S33C/K35H、S33H/K35H、S33C/K35C
和
S33H/K35C。23.
根据前述权利要求中任一项所述的人工
TRAP
笼作为用于递送其外部装饰物的递送载体的用途
。24.
根据权利要求
23
所述的用途，其中，所述递送用于细胞内递送
。25.
根据权利要求1至
22
中任一项所述的人工
TRAP
笼作为疫苗的用途
。26.
根据前述权利要求中任一项所述的笼作为药物的用途
。27.
一种治疗患者的方法，包括向所述患者给药根据权利要求1至
22
中任一项所述的笼
。28.
根据权利要求1至
22
中任一项所述的笼，用于治疗患者的疾病的用途，优选地，其中所述患者患有癌症
、
血管疾病
、
心血管疾病
、
糖尿病
、
感染
、
自身免疫疾病
、
神经病学
/
神经退行性疾病
、
关节炎和呼吸系统疾病
。30.
一种制备人工
TRAP
笼的方法，所述方法包括
:(i)
通过在合适的表达系统中表达
TRAP
环单元并从所述表达系统纯化所述单元来获得所述
TRAP
环单元；
(ii)
用交联剂通过至少一个自由巯基键连接来缀合所述
TRAP
环单元；
(iii)
通过自组装形成
TRAP
笼，并将所形成的
TRAP
笼的外部表面修饰为适合于将要附接到所述笼的外部表面的外部装饰物的外部表面；
(iv)
用部分装饰所述
TRAP
笼的外部表面，所述部分优选选自包括以下的组：纳米抗体
、
抗体
、
表位
、
抗原
、
蛋白质<...

【专利技术属性】
技术研发人员：乔纳森，
申请(专利权)人：雅盖隆大学，
类型：发明
国别省市：