牙鲆淋巴囊肿病基因工程疫苗及其生产方法技术

一种牙鲆淋巴囊肿病基因工程疫苗及其生产方法，其特征是该基因工程疫苗由大小为０．６ｋｂ的淋巴囊肿病毒核衣壳蛋白基因ＭＣＰ片段，插入到真核表达载体ｐＥＧＦＰ－Ｎ２中构成的重组质粒ｐＥＧＦＰ－Ｎ２－ＬＣＤＶ－ＭＣＰ?０．６ｋｂ。将其转化入大肠杆菌制备生产用菌种，划线到Ｍｉ?ｎｃａ琼脂平板、分离纯化、制备并确定合格的一级种子，再接种于琼脂扁瓶中，在３７℃培养后２４－４８ｈ后，对其鉴定确定合格的二级种子；再发酵培养得到发酵的二级种子培养菌液；进行菌体收集、离心、质粒ＤＮＡ提取、纯化，进行常规检验合格者即得。本发明专利技术完整的生产工艺简便、稳定性好和成本低；比目前的灭活疫苗、减毒疫苗、多肽疫苗、亚单位疫苗和重组多肽疫苗等免疫效果好、安全无副作用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种海水鱼病毒病基因工程疫苗及其生产方法，特别涉及一种牙鲆淋 巴囊肿病毒病基因工程疫苗及其生产方法。
技术介绍
淋巴囊肿病是由淋巴囊肿病毒引起的病毒性传染病，具有水平和垂直双重传播的 特点，可感染多种鱼类，是在中国海水养殖鱼中大规模流行的首例病毒性疾病，该病在我国 重要养殖经济鱼类牙鲆、真鲷、石斑鱼、鲈鱼、等名贵鱼种中广泛传播，造成了严重的经济损 失。目前，我国海水养殖病害控制仍以抗生素等化学药物为主，药物的滥用导致了水产品药 残，严重影响了食品安全。此外，抗生素和化学药品的大量使用还造成了病原微生物耐药性 增加及养殖环境恶化，妨碍了产业和经济的发展。因此，疫苗是治疗病毒病的最好选择。基 因工程疫苗是将外源基因克隆到真核质粒表达载体上，然后将重组质粒DNA注射到动物体 内，当外源基因进入活体细胞内并表达后，既可诱导体液免疫反应，也可诱导长期的免疫记 忆，被誉为第三代疫苗，大规模制备临床级质粒DNA的生产加工工艺逐渐受到关注，但由于 基因工程疫苗不同于以往的传统疫苗，工程菌的选择、制备工艺和生产方法等都不成熟，更 没有相关的质量保证体系，这极大地阻碍了该产业的发展。目前，国内外获得上市的基因工 程疫苗仅有马西尼罗病毒的基因工程疫苗West Nile Innovator和鲑鱼传染性出血性坏死 病毒的基因工程疫苗APEX-IHN。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种，以实现该 疫苗的规模化生产，该生产方法克服了基因工程疫苗生产工艺的缺陷，弥补了现有技术的 不足。上述牙鲆淋巴囊肿病基因工程疫苗是由大小为0.6kb的淋巴囊肿病毒核衣壳蛋白 基因MCP片段插入到真核表达载体pEGFP-N2中构成的重组质粒pEGFP-N2-LCDV-MCP0. 6kb， 插入到基因工程疫苗中的淋巴囊肿病毒核衣壳蛋白基因MCP片段序列为ATGATCGGTAATACTATTGATATGACACAACCCGTTGATTCCAATGGTCAATTACCTGAAGAAGTGTTA ATACTTCCTTTACCTTATTTCTTTTCTCGAGATAGCGGTATGGCTTTACCCAGCGCTGCTTTGCCTTATAATGAAAT AAGATTAACTTTTCATCTGAGAGATTGGACTGAATTATTGATCTTTCAAAATAAAAACGACTCTACCATCATGCCTT TGACAGCAGGCGATTTAGACTGGGGTAAACCTGATTTAAAGGATGTGCAAGTATGGATTACTAATGTAGTAGTAACC AATGAGGAACGTCGTTTAATGGGTACAGTACCTAGAGACATCTTGGTGGAACAGGTACAAACAGCACCTAAACATGT ATTTCAACCTCTAACTATTCCAAGTCCTAATTTTGACATCAGATTTTCTCATGCCATTAAAATCCT TTTTTTCGGT GTGCGTAATGTTACCTATCAAGCTATACAATCCAATTACACCAGTTCTTCTCCTGTAATCTTTGACGGTGGAATTGC TAGCGATTTACCGGGTATTGCTGCTGATCCTATTTCAAATGTTACCTTGGTTTATGAAAATAGTGCTCGTCTTAATG AAATGGGTAGTGAATAT。本专利技术的生产方法首先制备牙鲆淋巴囊肿病基因工程疫苗质粒库；然后将上述牙鲆淋巴囊肿病基因工程疫苗转化入大肠杆菌制备生产用菌种K12 DH-5 α -IXDVO. 6kb ；再 将该生产用菌种划线到Minca琼脂平板、分离纯化制备一级生产种子，并对其鉴定确定合 格的一级种子；再将该合格的一级种子接种于若干琼脂扁瓶中，在37°C培养后24-48h后得 二级生产种子，并对其鉴定确定合格的二级种子；再将该合格的二级种子在发酵罐中无菌 条件下进行发酵培养，得到发酵的二级种子培菌液；最后对该二级种子培养菌液进行菌体 收集、离心、质粒DNA提取、纯化，再对提取得到质粒DNA分别进行无菌、DNA纯度、外源DNA 含量、内毒素、蛋白质、超螺旋质粒含量的检验，检测合格者即得到淋巴囊肿病半成品的因 工程疫苗，再经过常规的效力检验和安全检验，合格者即为生产用牙鲆淋巴囊肿病毒病基 因工程疫苗成品。详细叙述上述各步骤如下1、制备牙鲆淋巴囊肿病基因工程疫苗质粒库首先在真核表达载体 PEGFP-N2 (pEGFP-N2载体为常用真核表达载体，购买于clontech公司、大小为4736bp，具有 高拷贝数、高效表达、加强型绿荧光蛋白标记和卡那霉素抗性标记等特点，宿主为DH5a)的 多克隆位点处通过SphI和EcoRI双酶切克隆入抗原编码基因MCP 0. 6kb片段、并经Bam HI 和NotI双酶切去除EGFP基因后，得到重组质粒pEGFP-N2-LCDV-MCP0. 6kb,全长4. 7kb,即 为牙鲆淋巴囊肿病基因工程疫苗质粒库；上述抗原编码基因的获得 是由接种牙鲆淋巴囊肿 病毒中国株(IXDV-cn)的牙鲆鳃细胞系re-9307，经RNA提取、反转录合成cDNA，并针对MCP 设计特异性引物，经PCR扩增，PCR产物经测序仪测序鉴定获得的624bp IXDV-cn MCP基因 片段。2、基因工程疫苗生产用菌种的制备然后将上述重组质粒 PEGFP-N2-LCDV-MCP0. 6kb加入到盛有感受态K12DH-5 α细胞的1. 5mL离心管中，重组质粒 的体积不得超过感受态细胞的5%，轻轻旋转该离心管混勻，然后42°C热激90s (期间不要 摇动)后迅速将该离心管移到冰浴中，使细胞冷却l-2min，向每200 μ L感受态细胞中，加入 800μ 的SOC培养基(配方为2% (W/V)胰蛋白胨，0.5% (W/V)酵母浸出汁，0.05% (W/ V)NaCl, 2. 5mM KCl, IOmM MgCl2, 20mM葡萄糖)，然后将管放在37°C摇床上，温育45min，即 得到生产用菌种K12DH-5 α -LCDV0. 6kb。3、基因工程疫苗一级种子的制备方法将上述生产用菌种划线到Minca琼脂平 板，并且按常规方法分离纯化，用0. 01mol/L pH7. 2的PBS缓冲液洗下菌落作为一级种子， 将其分装在5mL灭菌小瓶中，加10%甘油混勻，-70°C保存；上述PBS是由每升三蒸水含8g Nacl, 0. 2g Kcl，1. 44g Na2HPO4,0. 2g KH2PO4,调 ρΗ7· 2，灭菌 20min 制备而成，室温保存。4、基因工程疫苗一级种子的鉴定以确定合格的一级种子接种一级生产种子至含 30ug/mL卡那霉素的LB液体培养基，在160-190转/分的摇床上37°C培养，取趋于饱和期 的细菌，碱裂解法提取质粒DNA，依次用PCR方法和Xbal和EcoRl双酶切进行鉴定，PCR方 法和双酶切方法的产物经电泳和测序鉴定，条带大小为0. 6kb和无突变及其它非目的性重 组的产生为合格的基因工程疫苗的一级种子。上述LB液体培养基是由每升蒸馏水中含IOg 胰蛋白胨，5g酵母浸出汁，5g NaCl，调pH为7. 0，灭菌20min制备而成，室温保存。上述的PCR方本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种牙鲆淋巴囊肿病基因工程疫苗，特征在于该疫苗由大小为０．６ｋｂ的淋巴囊肿病毒核衣壳蛋白基因ＭＣＰ片段，插入到真核表达载体ｐＥＧＦＰ－Ｎ２中构成的重组质粒ｐＥＧＦＰ－Ｎ２－ＬＣＤＶ－ＭＣＰ　０．６ｋｂ，插入到核酸疫苗中的淋巴囊肿病毒核衣壳蛋白基因ＭＣＰ片段序列为：ＡＴＧＡＴＣＧＧＴＡＡＴＡＣＴＡＴＴＧＡＴＡＴＧＡＣＡＣＡＡＣＣＣＧＴＴＧＡＴＴＣＣＡＡＴＧＧＴＣＡＡＴＴＡＣＣＴＧＡＡＧＡＡＧＴＧＴＴＡＡＴＡＣＴＴＣＣＴＴＴＡＣＣＴＴＡＴＴＴＣＴＴＴＴＣＴＣＧＡＧＡＴＡＧＣＧＧＴＡＴＧＧＣＴＴＴＡＣＣＣＡＧＣＧＣＴＧＣＴＴＴＧＣＣＴＴＡＴＡＡＴＧＡＡＡＴＡＡＧＡＴＴＡＡＣＴＴＴＴＣＡＴＣＴＧＡＧＡＧＡＴＴＧＧＡＣＴＧＡＡＴＴＡＴＴＧＡＴＣＴＴＴＣＡＡＡＡＴＡＡＡＡＡＣＧＡＣＴＣＴＡＣＣＡＴＣＡＴＧＣＣＴＴＴＧＡＣＡＧＣＡＧＧＣＧＡＴＴＴＡＧＡＣＴＧＧＧＧＴＡＡＡＣＣＴＧＡＴＴＴＡＡＡＧＧＡＴＧＴＧＣＡＡＧＴＡＴＧＧＡＴＴＡＣＴＡＡＴＧＴＡＧＴＡＧＴＡＡＣＣＡＡＴＧＡＧＧＡＡＣＧＴＣＧＴＴＴＡＡＴＧＧＧＴＡＣＡＧＴＡＣＣＴＡＧＡＧＡＣＡＴＣＴＴＧＧＴＧＧＡＡＣＡＧＧＴＡＣＡＡＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＡＡＣＡＴＧＴＡＴＴＴＣＡＡＣＣＴＣＴＡＡＣＴＡＴＴＣＣＡＡＧＴＣＣＴＡＡＴＴＴＴＧＡＣＡＴＣＡＧＡＴＴＴＴＣＴＣＡＴＧＣＣＡＴＴＡＡＡＡＴＣＣＴＴＴＴＴＴＴＣＧＧＴＧＴＧＣＧＴＡＡＴＧＴＴＡＣＣＴＡＴＣＡＡＧＣＴＡＴＡＣＡＡＴＣＣＡＡＴＴＡＣＡＣＣＡＧＴＴＣＴＴＣＴＣＣＴＧＴＡＡＴＣＴＴＴＧＡＣＧＧＴＧＧＡＡＴＴＧＣＴＡＧＣＧＡＴＴＴＡＣＣＧＧＧＴＡＴＴＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＣＴＡＴＴＴＣＡＡＡＴＧＴＴＡＣＣＴＴＧＧＴＴＴＡＴＧＡＡＡＡＴＡＧＴＧＣＴＣＧＴＣＴＴＡＡＴＧＡＡＡＴＧＧＧＴＡＧＴＧＡＡＴＡＴ其中Ａ为腺嘌呤脱氧核糖核苷酸，Ｇ为鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸，Ｃ为胞嘧啶脱氧核糖核苷酸，Ｔ为胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：孙修勤，郑风荣，吴谡琦，吴兴安，沈志强，曲凌云，张进兴，洪旭光，郑明刚，
申请(专利权)人：国家海洋局第一海洋研究所，
类型：发明
国别省市：95[中国|青岛]