提高效率和准确性的基因组编辑制造技术

本发明专利技术提供了用于增强先导编辑的组合物和方法，其包括编码靶蛋白中的靶突变的

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】提高效率和准确性的基因组编辑

技术介绍

[0001]基因组编辑是一种基因工程的新形式，其使用工程核酸酶
(
分子剪刀
)
在活生物体的基因组中插入
、
缺失或替换
DNA。
利用基因组编辑工具对细胞和活生物体的基因组进行基因操作在生命科学研究
、
生物技术
、
农业技术以及最重要的疾病治疗中具有广泛的兴趣
。
例如，基因组编辑可用于校正导致遗传疾病的驱动突变，从而治愈活生物体中的这些疾病；基因组编辑也可应用于改造作物的基因组，从而增加作物产量并赋予作物对环境污染或病原体感染的抗性；同样地，通过精确的基因组编辑进行微生物基因组转化在可再生生物能源的开发中具有重要意义
。
[0002]CRISPR/Cas(
成簇规律间隔短回文重复序列
/CRISPR
相关蛋白
)
系统因其高编辑效率
、
便利性和在活生物体中的潜在应用而成为最强大的基因组编辑工具
。
在向导
RNA(gRNA)
的引导下，
Cas
核酸酶可以在各种细胞
(
细胞系和来自活生物体的原代细胞
)
的靶基因组位点产生
DNA
双链断裂
(DSBs)。
这些
DSBs
随后被内源性
DNA
修复系统修复，该修复系统可用于进行所需的基因组编辑
。
[0003]一般而言，
DSBs
可激活两种主要的
DNA
修复途径，非同源末端连接
(NHEJ)
和同源定向修复
(HDR)。NHEJ
可以在
DSBs
周围的基因组
DNA
区域引入随机的插入
/
缺失
(indels)
，从而导致开放阅读框
(ORF)
移位并最终导致基因失活
。
相反，当
HDR
被触发时，靶位点的基因组
DNA
序列可以通过同源重组机制被外源供体
DNA
模板的序列替换，这可以导致基因突变的校正
。
然而，
HDR
介导的基因校正的实际效率很低
(
通常低于5％
)
，因为同源重组的发生是细胞类型特异性的和细胞周期依赖性的，并且
NHEJ
比
HDR
更频繁地被触发
。
因此，
HDR
相对较低的效率限制了
CRISPR/Cas
基因组编辑工具在涉及基因校正的治疗领域的转化
。
[0004]整合了
CRISPR/Cas
系统和逆转录酶
(RTase)
家族的先导编辑
(Prime editor
，
PE)
最近被专利技术并用于基因校正
。
通过与
Cas9
切口酶
(nCas9
，
H840A)
融合，
RTase
可以通过使用先导编辑
gRNA(pegRNA)
中编码的遗传信息在靶基因组基因座来介导逆转录，然后触发互补
DNA(cDNA)
整合入基因组
DNA
，从而最终导致预期的编辑
。
[0005]然而，与其他基因组编辑器相比，
PE
的编辑效率相对较低，尤其是在产生单个碱基变化时
。
因此，开发具有高编辑效率的新的先导编辑系统是需要的
。
这种先导编辑系统将使我们能够在各种活生物体中进行高水平的编辑
。
重要的是，这些新的先导编辑系统的高效率将促进潜在的临床转化，特别是在那些涉及校正疾病相关的单点突变的临床转化中
。
[0006]专利技术概述
[0007]本文发现，通过将一个或多个沉默突变
(
编码序列中不引起氨基酸改变的突变或仅影响非编码
DNA
的突变
)
引入先导编辑
gRNA(pegRNA)
，可大大增强先导编辑的编辑效率
。
先导编辑系统采用的内源性错配修复
(MMR)
系统在修复单碱基错配方面效率不高
。
据推测，在
pegRNAs
中引入的沉默突变可以导致更多的错配和更大的
DNA
结构扭曲，导致增强的
MMR
激活和先导编辑
。
[0008]因此，根据本公开的一个实施方案，提供了一种用于在细胞中的蛋白中产生靶突变的方法
。
在一些实施方案中，所述方法包括向细胞引入先导编辑系统，其中所述先导编辑
系统包括融合蛋白和先导编辑向导
RNA(pegRNA)
，所述融合蛋白包括切口酶和逆转录酶，所述先导编辑向导
RNA
编码所述靶突变和距靶突变
20
个核苷酸内的一个或多个沉默或保守突变
。
[0009]在另一个实施方案中，提供了一种向细胞中的蛋白引入突变的方法，其包括向细胞引入先导编辑系统，其中所述先导编辑系统包括融合蛋白和先导编辑向导
RNA(pegRNA)
，所述融合蛋白包括切口酶和逆转录酶，所述先导编辑向导
RNA
编码所述蛋白的编码序列内的两个或多个突变，其中至少一个突变为沉默或保守突变，并且距另一个突变
20
个核苷酸以内
。
[0010]在一个实施方案中，还提供了一种先导编辑向导
RNA(pegRNA)
，其包含一个片段，所述片段
(a)
能够与人
ACE2(
血管紧张素转换酶
2)
的基因组序列杂交，
(b)
编码选自由
S19、Q24、D30、K31
或
K353
组成的组的一个或多个残基处的靶突变，所述残基的位点基于
SEQ ID NO:1。
本专利技术还提供了该突变蛋白
、
编码突变蛋白的多核苷酸
、
含有突变蛋白的细胞和特异性识别突变蛋白的抗体
。
[0011]本专利技术还提供了一种先导编辑系统，其包括本公开的
pegRNA
以及包括切口酶和逆转录酶的融合蛋白
。
[0012]本专利技术还提供了用于治疗或预防冠状病毒感染的方法
。
在一些实施方案中，所述方法包括向受试者施用编码本公开的先导编辑系统的一种或多种多核苷酸
。
在一些实施方案中，冠状病毒为
SARS
‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.
一种用于在细胞中的蛋白中产生靶突变的方法，其包括向细胞引入先导编辑系统，其中所述先导编辑系统包括融合蛋白和先导编辑向导
RNA(pegRNA)
，所述融合蛋白包括切口酶和逆转录酶，所述先导编辑向导
RNA
编码所述靶突变和距所述靶突变
20
个核苷酸内的一个或多个沉默或保守突变
。2.
如权利要求1所述的方法，其中所述
pegRNA
编码至少1个沉默或保守突变
。3.
如权利要求1所述的方法，其中所述
pegRNA
编码2至4个沉默或保守突变
。4.
如权利要求1‑3中任一项所述的方法，其中每个突变处于与其它突变不同的密码子中
。5.
如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述切口酶为
Cas9 H840A。6.
如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述逆转录酶为
M
‑
MLV
逆转录酶
。7.
如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述融合蛋白以编码所述融合蛋白的重组
DNA
的形式引入
。8.
如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述
pegRNA
以编码所述
pegRNA
的重组
DNA
引入
。9.
如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述靶突变位于人
ACE2(
血管紧张素转换酶
2)
的
S19、Q24、D30
或
K31
的一个或多个残基处，其中位点基于
SEQ ID NO:1。10.
如权利要求9所述的方法，其中所述靶突变位于人
ACE2(
血管紧张素转换酶
2)
的
Q24、D30、K31A
或
K353
的一个或多个残基处，其中所述位点基于
SEQ ID NO:1。11.
如权利要求
10
所述的方法，其中所述靶突变为非保守突变
。12.
如权利要求
10
所述的方法，其中突变包括
K353del、Q24A/D30A/K31A
或
Q24A/D30K/K31A。13.
一种向细胞中的蛋白引入突变的方法，其包括向细胞引入先导编辑系统，其中所述先导编辑系统包括融合蛋白和先导编辑向导
RNA(pegRNA)
，所述融合蛋白包括切口酶和逆转录酶，所述先导编辑向导
RNA
编码所述蛋白的编码序列内的两个或多个突变，其中至少一个突变为沉默或保守突变，并且距另一个突变
20
个核苷酸以内
。14.
一种先导编辑向导
RNA(pegRNA)
，其包含片段，所述片段
(a)
能够与人
ACE2(
血管紧张素转换酶
2)
的基因组序列杂交，
(b)
编码选自由
S19、Q24、D30、K31
和
K353
组成的组中的一个或多个残基处的靶突变，其位点基于
SEQ ID NO:1。15.
如权利要求
14
所述的
pegRNA
，其中所述靶突变选自由
Q24A、D30A、D30K、K31A
和
K353del
组成的组
。16.
如权利要求
14
所述的
pegRNA
，其中所述片段进一步包含距所述靶突变
20
个核苷酸内的一个或多个沉默突变
。17.
如权利要求
16
所述的
pegRNA
，其中所述片段包括2至4个沉默突变
。18.
如权利要求
16
或
17
所述的
pegRNA
，其中至少一个所述沉默突变距所述靶突变至少2个核苷酸
。19.
一种先导编辑系统，其包括如权利要求
...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈佳，杨贝，杨力，李潇飒，王潇，赵文文，周丽娜，李吉方，
申请(专利权)人：上海科技大学，
类型：发明
国别省市：