一种高纯几丁质酶蛋白晶体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种高纯几丁质酶蛋白晶体及其制备方法和应用

【技术实现步骤摘要】
一种高纯几丁质酶蛋白晶体及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种高纯几丁质酶蛋白晶体结构及晶体制备方法和解析方法
。

技术介绍

[0002]胞囊线虫在全世界范围内广泛分布，是一类能够引起许多重要作物产量严重损失的害虫
。
以危害最严重的大豆胞囊线虫
(Soybean Cyst Nematode,Heteroderaglycines,SCN)
为例，其是大豆上的主要害虫之一，在大豆整个生育期均可为害，一般会造成5‑
10
％的产量损失，发病严重地块减产可达
30
％以上，甚至颗粒无收，导致严重减产并造成较大经济损失
。
除了对大豆的危害，大豆孢囊线虫还会影响根瘤菌结瘤共生的建立，导致根瘤固氮能力减弱，进一步导致大豆减产
。
然而，目前针对孢囊线虫还没有有效的防控方法，因此，亟需开发防治孢囊线虫的新方法
。
[0003]已有研究表明，几丁质是胞囊线虫卵的组成成分，位于外卵黄层和内脂质层之间，主要具有防止多精入卵和阻隔外部环境的功能，对胚胎的进一步发育至关重要
。
除了卵壳，胞囊线虫的咽部和取食部位也含有几丁质，在寄生过程中发挥重要作用
(Chen,Q.et al.,Nematode chitin and application.Adv.Exp.Med.Biol.2019,1142:209
‑
219)。
因此孢囊线虫几丁质酶也是理想的防治大豆孢囊线虫病的潜在靶标
。
此外，胞囊线虫从被根吸引至根尖到形成合胞体的这一过程中会分泌很多效应蛋白来帮助它完成侵染和定殖过程
。
其中大豆孢囊线虫几丁质酶
HgCht2(
也被称为
Hg
‑
CHI
‑
1)
作为一种在侵染前期高表达的效应蛋白，具有结瘤因子水解活性，在大豆孢囊线虫抑制根瘤菌共生过程中发挥重要作用
。
所以孢囊线虫几丁质酶也是理想的豆科植物共生保护剂靶标
。
[0004]综上所述，孢囊线虫几丁质酶在农业领域具有重要的应用前景，获得孢囊线虫几丁质酶的三维结构对于了解其生物功能和设计靶向农药等方面具有非常重要的作用
。
因此，获得孢囊线虫几丁质酶功能结构域晶体及解析其三维结构值得深入研究，然而目前国内外尚无相关报道
。

技术实现思路

[0005]鉴于现有技术的需求，通过纯化工艺的探索，本专利技术提供纯化孢囊线虫几丁质酶的纯化方法，使用该方法获得了高纯的大豆孢囊线虫的几丁质酶，制备了其蛋白晶体并且解析了晶体结构
。
[0006]本专利技术解决上述技术问题的技术方案如下：
[0007]本专利技术提供一种大豆孢囊线虫几丁质酶蛋白晶体，该晶体具有空间群
P1211
，一个不对称单位中有一个分子，晶胞参数为
[0008]上述几丁质酶蛋白的表达纯化方法，包括如下步骤：
[0009](1)
构建几丁质酶表达载体
[0010]将目的基因与载体连接，得重组质粒，然后将重组质粒转化到感受态细胞中进行
培养，挑取单克隆菌落进行扩增，测序；
[0011]步骤
(1)
具体操作是，将目的基因进行毕赤酵母偏好性的密码子优化后，进行基因合成，合成的基因克隆至
pPIC9
载体中
。
[0012](2)
几丁质酶的重组表达
[0013]将测序正确的几丁质酶重组载体转化到宿主细胞中，得到表达几丁质酶的菌株
。
将表达菌株接种到培养基中进行培养，离心收集培养基上清液；
[0014]步骤
(2)
具体操作是，将构建好的含有几丁质酶的
pPIC9
质粒通过点击法转化至毕赤酵母
GS115
感受态细胞中
。30℃
摇床培养2小时
。
然后将菌液涂布于组氨酸缺陷型固体平板中，
30℃
静止培养
48
小时，直至观察到大小合适的单菌落
。
将观察到的单菌落全部挑取出来溶于
50
μ
L
无菌水中，利用沸水和液氮进行反复冻融3次后，离心收集上清，作为模板进行
PCR
片段扩增，确定阳性单菌落
。
将选取的阳性单克隆利用
YPD
液体培养基进行活化，至
OD
值为
1.3
‑
1.5
后，以1：
100
的比例接种至
BMGY
液体培养基中，
30℃
摇床
200rpm
培养过夜至
OD
值为
2.0。
然后室温条件下离心收集菌体，离心条件为
3000g。
然后将菌体转移至
BMMY
液体培养基中，以相同的培养条件继续培养5天，期间每天加入1％
(v/v)
的甲醇
。
随后室温条件下
8000g
离心
30
分钟，收集上清
。
[0015](3)
几丁质酶的纯化
[0016]将含有几丁质酶的培养基上清液加载能结合
His
亲和标签的柱子或凝胶，例如
HisTrap HP
亲和层析柱上，先以
pH7.0
‑
8.0
的缓冲液平衡柱子，再以含有低浓度咪唑的
pH7.0
‑
8.0
的缓冲液清洗杂质，最后以含有高浓度咪唑的
pH7.0
‑
8.0
的缓冲液洗脱目的蛋白；所述几丁质酶含有
His
标签，优选地为所述
His
标签为
6*His
标签
。
[0017]步骤
(3)
具体操作是，在
4℃
条件下向发酵液上清中缓慢加入
500g/L
的硫酸铵，为防止局部盐浓度过高，整个过程需要持续搅拌，待硫酸铵完全溶解后静置过夜
。4℃
离心收集沉淀，然后在
4℃
条件下用
buffer A
溶解，再次
4℃
离心去除未溶解的杂质
。
上清过
0.22
μ
m
孔径滤器再次去除细小杂质，然后使用脱盐预装柱去除样品中的盐
。
将脱盐后的样品加载至已经用
buffer A
平衡好的
HisTrap HP
亲和层析柱中，然后用
20
个柱体积的
bufferA
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种大豆孢囊线虫几丁质酶蛋白晶体，该晶体具有空间群
P1211
，一个不对称单位中有一个分子，晶胞参数为
a=46.80
Å
, b=69.35
ꢀÅ
, c=50.56
ꢀÅ
；所述几丁质酶蛋白是大豆孢囊线虫的
HgCht2
，其氨基酸序列的
NCBI
登录号为
AAN14978.1
，或者与大豆孢囊线虫的
HgCht2
的氨基酸序列同一性
98%
以上或
99%
以上的来自孢囊线虫的几丁质酶
。2.
如权利要求1所述的几丁质酶蛋白晶体的制备方法，其特征在于，将纯化的所述几丁质酶蛋白于
0.1 M 乙酸铵，
0.1 M Bis
‑
tris
，
pH 5.5
和
20% PEG 10,000
的条件下进行晶体生长而得到；优选地，采用悬滴气相扩散法进行结晶生长；任选地，将几丁质酶蛋白晶体转移至防冻液中，置于液氮中保存
。3.
如权利要求2所述的几丁质酶蛋白晶体的制备方法，其特征在于，所述纯化的所述几丁质酶蛋白是经过镍离子亲和层析分离纯化后脱盐至
20 mMTris
‑
HCl 缓冲液
(pH 7.0
，
100 mMNaCl)
后，经离心浓缩至
15 mg/mL。4.
如权利要求3所述的几丁质酶蛋白晶体的制备方法，其特征在于，所述防冻液为晶体生长条件下补加
20
‑
25%
甘油作为冷冻保护剂
。5.
如权利要求4所述的几丁质酶蛋白晶体的制备方法，其特征在于，所述纯化的几丁质酶蛋白按如下方法制备得到：通过含带有
His
亲和标签的所述几丁质酶蛋白的编码基因的重组表达宿主菌表达获得所述含有所述几丁质酶蛋白的培养液，离心收集上清液；将上清液加载能结合
His
亲和标签的柱子或凝胶，先以
pH7.0
‑
8.0
的缓冲液平衡柱子，再以含有低浓度咪唑的
pH7.0
‑
8.0
的缓冲液清洗杂质，最后以含有高浓度咪唑的
pH7.0
‑
8.0
的缓冲液洗脱目的蛋白，即得
。6.
如权利要求3所述的几丁质酶蛋白晶体的制备方法，其特征在于，所述纯化和脱盐的具体操作是：在
4 ℃
条件下向发酵液上清中缓慢加入
500 g/L
的硫酸铵，整个过程需要持...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨青，陈威，
申请(专利权)人：中国农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：