应用含有二糖和葡萄糖的培养基高产量生产合子样子叶型松树胚的方法技术

本发明专利技术提供生产子叶型松树胚的方法。本发明专利技术方法各包括在含有二糖和葡萄糖的培养基上或其内培养松树胚发生组织以产生子叶型松树胚的步骤，其中二糖和葡萄糖在培养基中的浓度都小于３％。本发明专利技术还提供根据本发明专利技术方法制备的子叶型松树胚。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及在植物体外生产植物胚，并从植物胚任意生产植株的方法。一种克隆松树的方法是在促进松树胚形成的条件下，对离体的活的松树组织进行体外处理，然后由处理的组织获得整个植株。可以在一种或多种植物生长激素和/或细胞分裂素的存在下培养离体的松树组织，来促进胚发生组织的形成和增殖，之后在促进子叶型松树胚形成的条件下培养该组织。然后使胚发芽长成松树。松树胚生成组织的一个实例是胚胎胚柄物质(embryonal suspensor masses)(ESMs)，其可通过体外组织培养由松树胚形成，所述松树胚从松树种子全裂而成。附图说明图1显示的是液体培养物中的胚胎胚柄物质。图2显示的是由ESM形成的子叶型松树胚(可在胚顶部看到子叶)。但是一个持续的问题正促进子叶型松树胚的有效形成，该胚可以高频率地发芽来产生松树植株。优选该体外形成的子叶型松树胚与在松树种子内，即在体内形成的合子型松树胚在形态学、解剖学和生物化学上都相似或相同。特别是，需要有方法能够比现有技术的方法体外生产更大量的合子样子叶型松树胚。优选地，通过本专利技术新方法生产的子叶型松树胚的发芽率和质量都高于现有技术方法所生产的子叶型松树胚。本专利技术的方法各包括在含有二糖和葡萄糖的培养基之内或其上培养松树胚发生组织以产生子叶型松树胚的步骤，其中，二糖和葡萄糖在培养基中的浓度都小于3％(即，二糖在培养基中的浓度小于3％，葡萄糖在培养基中的浓度小于3％)。在一些实施方案中，该培养基包含葡萄糖(浓度小于3％)以及至少两种二糖，其中培养基中所有二糖的总浓度小于3％。该培养基还可以含有一种或多种吸收剂成分。本专利技术的方法还可进一步包括从根据本专利技术所制备的子叶型松树胚生产一株或多株松树(例如松树种群)的步骤。在本专利技术的一些实施方案的实践中，在至少两种培养基上或其内持续培养胚发生组织，所述培养基的至少一种含有二糖和葡萄糖，二糖和葡萄糖在培养基中的浓度均小于3％。含有二糖和葡萄糖的培养基适于促进从胚发生组织到子叶型胚的发育及成熟。这样，在一些实施方案中，本专利技术提供了产生子叶型松树胚的一些方法，该方法各包括以下步骤(a)在维持培养基上或在该培养基内培养胚发生组织(例如松树胚胚柄物质)；以及(b)在含有二糖和葡萄糖的发育培养基上培养根据步骤(a)处理的松树胚发生组织以形成子叶型松树胚，其中二糖和葡萄糖在发育培养基中的浓度都小于3％。该发育培养基还可选择性地含有吸收剂成分。本专利技术这一方面的方法可以选择性地含有在起始培养基上或其内培养松树组织以获得胚发生组织的步骤，然后将该组织在如步骤(a)所述的维持培养基上或其内培养。另一方面，本专利技术提供根据本专利技术的方法制备的子叶型松树胚。本专利技术的方法可用于例如制备子叶型松树胚，该胚可例如通过遗传学上或生化手段而进一步具有一些特性，和/或可以使其发芽来产生小松树植株，如果需要的话，该植株可以长成成熟的松树。这样，本专利技术方法可以用于例如生产具有一种或多种期望特性，如生长速度快或木质改进的单株松树植株的克隆。例如，本专利技术的子叶型松树胚可以用于产生具有一种或多种期望特性，如生长速度快或木质改进的松树树林或森林。这些树木可用于生产木制品。图2显示使用本专利技术方法制备的具有代表性的子叶型松树胚(可在胚的顶部见到子叶)。在本文中，术语“子叶型胚”指具有一个或多个子叶的胚。术语“二糖”指由两个单糖残基构成的碳水化合物。二糖的代表性例子包括麦芽糖，蔗糖，乳糖，纤维二糖，异麦芽糖，龙胆二糖，昆布二糖(laminarabiose)，壳二糖，木二糖(xylobiose)，菊粉二糖，甘露二糖，玻璃样生物糖醛酸(hyalobiouronic acid)，软骨胶素，以及纤维二糖醛酸(cellobiouronic acid)。在本文中，术语“胚发生组织”指源自松科植株的任何组织，当用本专利技术的方法处理该组织时，其能够产生一个或多个子叶型松树胚。这样，术语“胚发生组织”包括例如松树胚胚柄物质。除非另有说明，所有以百分数方式表达的浓度数值都是重量每体积百分数。另一方面，本专利技术提供生产子叶型松树胚的方法。该方法包括在含有二糖和葡萄糖的培养基之内或其上培养松树胚发生组织以产生子叶型松树胚的步骤，其中，二糖和葡萄糖在培养基中的浓度都小于3％。在本专利技术方法的一些实施方案中，产生的子叶型松树胚中至少有50％(例如至少60％，或例如至少70％，或例如至少80％，或例如至少90％)是合子样的(即，与处于相同发育阶段的合子子叶型松树胚具有相同的形态学特征和生理学属性)。这样，本专利技术方法的一些实施方案中，所产生的子叶型松树胚中有50％-100％(例如60％-90％，或70-80％)是合子样的。根据本专利技术制备的子叶型松树胚通常都具有一种或多种下述特性与那些除了培养基中没有浓度小于百分之三的葡萄糖和/或二糖之外，其余处理相同的胚相比，本专利技术的胚更长(通常长出0.5mm-1.0mm)；每个胚都含有8-12子叶；并且根据本专利技术处理的胚与那些除了培养基中没有浓度大于百分之三的葡萄糖和/或二糖之外，其余处理相同的胚相比，发育更快(例如，在一些实施方案中，根据本专利技术制备的胚在9周内发育)。本专利技术的方法可用于生产松科家族任何成员的子叶型胚，例如松属(genus Pinus)植物如火炬松(Loblolly pine)(Pinus taeda)。可用于本专利技术的胚发生组织的一个实例是胚胎胚柄物质(ESMs)。ESMs可从取自松树种子的前子叶(precotyledonary)胚制备。在取出前子叶胚之前，种子通常要经过表面灭菌，然后将这些前子叶胚培养在能够形成ESMs的培养基上或其内，所述ESMs包括在通过出芽和分裂进行的增殖过程中的前期胚。如果需要的话，培养基可以含有能够刺激早期胚增殖的激素。可加入培养基中的激素可以是植物生长素(如2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D))和细胞分裂素(如6-苄氨基嘌呤(BAP))。植物生长素可以例如以1mg/L-200mg/L的浓度使用。细胞分裂素的使用浓度可以是0.1mg/L-10mg/L。用于培养松树前子叶型胚以诱导ESMs形成的培养基的实例为实施例1中所述BM1。本专利技术方法还包括在含有二糖和葡萄糖的培养基上或其内培养松树胚发生组织以产生子叶型松树胚的步骤，其中二糖和葡萄糖在培养基中的浓度都小于3％(例如小于2.9％，或例如小于2.8％，或例如小于2.7％，或例如小于2.6％，)。在本专利技术方法的一些实施方案中，二糖和葡萄糖在培养基中的浓度均为1％-2.5％。在本专利技术方法的一些实施方案中，二糖和葡萄糖在培养基中的浓度均为2％-2.5％。在本专利技术方法的一些实施方案中，二糖在培养基中的浓度为2.5％，葡萄糖在培养基中的浓度为1％。在本专利技术方法的一些实施方案中，培养基包含葡萄糖和至少两种二糖，其中葡萄糖在培养基中的浓度小于3％，而培养基中所有二糖的总浓度为1％到2.5％。在本专利技术方法的一些实施方案中，培养基包含葡萄糖和至少两种二糖，其中葡萄糖在培养基中的浓度小于3％，而培养基中所有二糖的总浓度为2％到2.5％。在本专利技术方法的一些实施方案中，在含有二糖和葡萄糖的培养基上或其内培养胚发生松树组织6周-12周时间，例如从8周到12周，或例如从9周到11周，其中二糖和葡萄糖的浓度都小于3％。在本专利技术方法本文档来自技高网...

【技术保护点】
生产子叶型松树胚的方法，所述方法包括在含有二糖和葡萄糖的培养基上或在该培养基内培养松树胚发生组织以产生子叶型松树胚的步骤，其中所述二糖和所述葡萄糖在培养基中的浓度均低于３％。

【技术特征摘要】
US 2002-4-9 60/371,279;US 2002-5-14 60/380，7471.生产子叶型松树胚的方法，所述方法包括在含有二糖和葡萄糖的培养基上或在该培养基内培养松树胚发生组织以产生子叶型松树胚的步骤，其中所述二糖和所述葡萄糖在培养基中的浓度均低于3％。2.权利要求1的方法，其中松树胚发生组织包含胚胎胚柄物质。3.权利要求1的方法，其中至少60％的子叶型松树胚具有6-12个子叶。4.权利要求1的方法，其中至少70％的子叶型松树胚具有6-12个子叶。5.权利要求1的方法，其中至少80％的子叶型松树胚具有6-12个子叶。6.权利要求1的方法，其中至少90％的子叶型松树胚具有6-12个子叶。7.权利要求1的方法，其中二糖和葡萄糖在培养基中的浓度均为1％-2.5％。8.权利要求1的方法，其中二糖和葡萄糖在培养基中的浓度均为2％-2.5％。9.权利要求1的方法，其中培养基含有至少两种二糖，其中二糖在培养基中的总浓度为1％-2.5％。10.权利要求1的方法，其中培养基含有至少两种二糖，其中二糖在培养基中的总浓度为2％-2.5％。11.权利要求1的方法，其中松树胚发生组织在含有二糖和葡萄糖的培养基上或在该培养基内培养6周-12周。12.权利要求1的方法，其中松树胚发生组织在含有二糖和葡萄糖的培养基上或在该培养基内培养8周-12周。13.权利要求1的方法，其中松树胚发生组织在含有二糖和葡萄糖的培养基上或在该培养基内培养9周-11周。14.权利要求1的方法，其中含有二糖和葡萄糖的培养基的重量摩尔渗透压浓度为250mM/kg-450mM/kg。15.权利要求1的方法，其中含有二糖和葡萄糖的培养基的pH为4.5-6.5。16.权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：巴莫德K古普塔，黛安娜霍尔姆斯特伦，邦尼拉森，
申请(专利权)人：韦尔豪泽公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]