一种卵母细胞成熟培养液及其应用制造技术

本发明专利技术涉及卵母细胞体外成熟培养技术领域，具体涉及一种卵母细胞成熟培养液及其应用

【技术实现步骤摘要】
一种卵母细胞成熟培养液及其应用


[0001]本专利技术涉及卵母细胞体外成熟培养
，具体涉及一种卵母细胞成熟培养液及其应用
。

技术介绍

[0002]卵母细胞体外成熟是指将处于第一次减数分裂生发泡期的卵母细胞放到体外成熟液中培养到第二次减数分裂卵母细胞生发泡破裂，排出第一极体的过程
。
在这个过程中，尽管成熟液模拟体内环境，但因为影响因素较多，卵母细胞体外成熟的质量明显低于体内成熟
。
卵母细胞成熟包括细胞核的成熟和细胞质的成熟，细胞核成熟和细胞质共同成熟对卵母细胞成熟的质量影响较大，对胚胎发育潜力有较大影响
。
影响卵母细胞成熟的因素有很多，卵巢贮存的时间与温度
、
卵巢卵泡大小及卵母细胞的类型
、
体外培养温度
、
气相
、
培养液成分
、
卵母细胞供体动物的年龄
。
[0003]此外，卵母细胞在体内发育时，卵母细胞处于低氧的环境中，卵泡液中含有的自由基清除剂和抗氧化酶可以保护卵母细胞免受氧化损伤，但在体外培养的过程中，卵母细胞失去了输卵管和子宫内环境的保护，卵母细胞暴露在高氧环境下，造成氧化还原失衡
。
[0004]研究开发能够有效促进卵母细胞体外培养成熟及成熟质量的产品
、
方法，对辅助生殖
的相关研究将有重大的意义
。

技术实现思路

[0005]本专利技术主要目的在于提供一种卵母细胞成熟培养液及其应用，本专利技术所述卵母细胞成熟培养液能够显著提高卵母细胞成熟率和卵母细胞质量
。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0007]本专利技术第一方面，提供一种卵母细胞成熟培养液，所述卵母细胞成熟培养液由以下成分组成：基础培养液，表没食子儿茶素没食子酸酯和褪黑素；表没食子儿茶素没食子酸酯工作浓度为8‑
15
μ
M
，褪黑素的工作浓度为
0.01
‑
0.5
μ
M。
[0008]进一步地，所述基础培养液由以下成分组成：
TCM199
培养液，胎牛血清，青霉素
‑
链霉素混合液，促黄体生成素，促卵泡生成激素，雌二醇和表皮生长因子
。
[0009]本专利技术第二方面，提供一种促进卵母细胞成熟的方法，所述方法包括以下步骤：
[0010]S1.
将以上第一方面所述卵母细胞成熟培养液制成微滴并覆盖石蜡油，得成熟培养液滴，置于培养箱中备用；
[0011]S2.
将卵母细胞在以上第一方面所述卵母细胞成熟培养液中进行清洗后，置于步骤
S1
所得成熟培养液滴中进行培养
。
[0012]本专利技术第三方面，提供以上第一方面所述卵母细胞成熟培养液在制备卵母细胞体外培养试剂中的应用
。
[0013]本专利技术第四方面，提供以上第一方面所述卵母细胞成熟培养液在制备卵母细胞抗氧化试剂中的应用
。
[0026][0027]其中，所述双抗为青霉素
‑
链霉素混合液
。
[0028]实施例1[0029]一种卵母细胞成熟培养液，所述卵母细胞成熟培养液由以下成分组成：基础培养液，
EGCG
和褪黑素；
EGCG
工作浓度为
10
μ
M
，褪黑素的工作浓度为
0.5
μ
M。
[0030]一种促进卵母细胞成熟的方法，所述方法包括以下步骤：
[0031]S1.
将以上所述卵母细胞成熟培养液制成
60
μ
L
微滴并覆盖石蜡油，得成熟培养液滴，置于
37℃、5
％ CO2培养箱中备用；
[0032]S2.
将带3层颗粒细胞的卵母细胞放入
M2
中清洗3遍，在以上所述卵母细胞成熟培养液中清洗3遍，置于步骤
S1
所得成熟培养液滴中进行培养
。
[0033]实施例2[0034]一种卵母细胞成熟培养液，所述卵母细胞成熟培养液由以下成分组成：基础培养液，
EGCG
和褪黑素；
EGCG
工作浓度为8μ
M
，褪黑素的工作浓度为
0.01
μ
M。
[0035]实施例3[0036]一种卵母细胞成熟培养液，所述卵母细胞成熟培养液由以下成分组成：基础培养液，
EGCG
和褪黑素；
EGCG
工作浓度为
15
μ
M
，褪黑素的工作浓度为
0.1
μ
M。
[0037]试验例
[0038](
一
)
试验方法
[0039]以8只健康的6‑8周龄母鼠为试验对象，腹腔注射
10U
的
PMSG
，
46h
后脱颈处死，打开腹腔，取出卵巢，置于
M2
操作液中，在体视镜下用
1mL
注射器将卵巢戳破，用捡卵针收集具有3层以上卵丘细胞包裹的卵丘细胞复合体
(COCs)。
[0040]采用实施例1‑3所述卵母细胞成熟培养液按实施例1所述方法进行卵母细胞培养，卵母细胞成熟后，进行第一极体排出率的统计，活性氧
、GSH
含量的检测
。
[0041](1)
小鼠卵母细胞第一极体排出
[0042]用透明质酸酶脱去卵丘，观察并记录第一极体的排出情况
。
[0043](2)ROS
荧光强度检测
[0044]1)、
将各组培养成熟的
COCs
移入透明质酸酶中用
100ul
移液枪轻轻吹打
60
次，脱去外层的卵丘细胞，放入成熟液滴中清洗三次，放入成熟液滴中
。
[0045]2)、
挑选出含有第一极体的卵母细胞，用
PBS(
含
0.1
％
PVA)
洗涤三次后放入
100ul
[0075][0076]注：
a
表示与对照组相比差异显著，
b
表示与实施例1相比差异显著，
p<0.001。
[0077]对照组与实施例
1、
对比例
2、
对比例5组相比，
GSH
的含量最低，且差异极显著
(p<0.001)。
实施例1组的
GSH
含量高于对比例5组，但没有显著差异
(p>0.001)。
实施例1组的
GSH<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种卵母细胞成熟培养液，其特征在于，其由以下成分组成：基础培养液，表没食子儿茶素没食子酸酯和褪黑素；表没食子儿茶素没食子酸酯工作浓度为8‑
15
μ
M
，褪黑素的工作浓度为
0.01
‑
0.5
μ
M。2.
根据权利要求1所述卵母细胞成熟培养液，其特征在于，所述基础培养液由以下成分组成：
TCM199
培养液，胎牛血清，青霉素
‑
链霉素混合液，促黄体生成素，促卵泡生成激素，雌二醇和表皮生长因子
...

【专利技术属性】
技术研发人员：马毅，李一，陈丽丽，芦娜，
申请(专利权)人：天津市农业科学院，
类型：发明
国别省市：