一种基于转座酶的制造技术

本发明专利技术属于测序文库构建技术领域，具体涉及一种基于转座酶的

【技术实现步骤摘要】
一种基于转座酶的GI\GII组诺如病毒靶向建库方法


[0001]本专利技术属于测序文库构建
，具体涉及一种基于转座酶的
GI\GII
组诺如病毒靶向建库方法
。

技术介绍

[0002]病毒基因组的成功获取需要从背景序列中有效筛选极少量的病毒序列，在病毒测序过程中，如何去除背景序列是非常关键的，背景序列中影响最大的是核糖体
RNA。
目前在转录组测序技术，去除核糖体
RNA
有两种方式：第一种是利用病毒自带的
poly
‑
A
尾，通过修饰
oligo
‑
T
的磁珠特异性富集
mRNA
；第二种是使用背景生物的随机核糖体
RNA
的特异性探针，捕获宿主及背景序列中的核糖体
RNA
并进一步去除
。
尽管这些方法可以实现对部分背景序列的去除，但是在针对病毒序列的测序中，宿主及背景的核酸读段仍然可以占到
99
％以上
。
背景序列的存在增加了测序需要的原始数据量和成本，也提高了后续生物信息学分析的难度
、
分析时间和储存消耗
。
由于诺如病毒序列的多样性和极不保守性，很难设计出对诺如病毒分段
PCR
或者全局式多重
PCR
的特异性引物，从而进行针对诺如病毒的特异性
NGS
建库分析
。
因此与其他种类病毒相比，获取
NoV
的全基因组序列更加困难
。
根据
VP1
氨基酸序列的聚类分析，诺如病毒可分为
10
个基因组
(Genogroup
，
GI
‑
GX)
，其中
GI
和
GII
组毒株最为常见
。
自上世纪
90
年代以来，
GII.4
型
NoV
是全球最主要的流行基因型，引起了
50
‑
70
％的疫情，因此本专利技术以
GI
和
GII
组诺如病毒为对象研发了基于转座酶的靶向建库方法
。
[0003]转座酶
(Transposase)
存在于原核生物和真核生物中，并以“剪切和粘贴”机制催化确定的
DNA
元件
(
转座子
)
移动到基因组的另一部分
。
利用这种催化活性，
DNA
片段化的同时将
DNA
末端连接上特定的接头
。
基于
Tn5
转座酶的
DNA
建库方法解决了传统方法建库时对物理超声打断的设备依赖，并且对样本的
DNA
起始投入量要求更低
。Tn5
已被广泛应用于高通量测序，生物信息学分析和酶结构学研究表明，它属于反转录病毒整合酶家族，不仅可以作用于
DNA
，也具有对
RNA
‑
cDNA
杂交链的体外标记活性，实现了体外特异性识别并同步打断
RNA
‑
cDNA
双链的功能，称为
Transposase
‑
assisted RNA
‑
DNA hybrids Co
‑
tagmEntation(TRACE
‑
seq)。
与传统
RNA
‑
seq
相比，
TRACE
‑
seq
具有更简单的操作步骤和更稳定的序列产出，但目前仍停留在理论层面，实际应用很少
。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种基于转座酶的
GI\GII
组诺如病毒靶向建库方法，基于
TRACE
‑
seq
理论构建基于转座酶的诺如病毒文库，并最终应用于诺如的全基因组测序
。
[0005]本专利技术提供了一种诺如病毒特异性反转录引物组，包括独立包装的
A
组引物和
B
组引物；
[0006]所述
A
组引物的核苷酸序列如
SEQ ID No.1
～
SEQ ID No.13
所示；
[0007]所述
B
组引物的核苷酸序列如
SEQ ID No.14
～
SEQ ID No.25
所示
。
[0008]本专利技术提供了一种诺如病毒特异性反转录方法，包括提取诺如病毒
RNA
后依次进
行预变性和
DNA
去除，得模板液；
[0009]将所述模板液分别与上述诺如病毒特异性反转录引物组中的
A
组引物和
B
组引物构建反转录体系，进行反转录反应，得
A
组的
RNA
‑
cDNA
双链和
B
组的
RNA
‑
cDNA
双链；
[0010]所述反转录体系以
10
μ
L
计，包括：
7.5
μ
L
模板液
、10
×
RTMix 1.0
μ
L、HiScript III Enzyme Mix 1.0
μ
L
和
A
组引物
/B
组引物
0.5
μ
L。
[0011]优选的，所述预变性包括将提取得到的诺如病毒
RNA
于
65℃
加热
5min
，然后在0～
4℃
环境中静置
2min。
[0012]优选的，所述反转录反应的程序，包括：
105℃
热盖；
25℃5min
；
37℃30min
；
85℃5s。
[0013]本专利技术还提供了一种诺如病毒的文库构建试剂盒，包括上述诺如病毒特异性反转录引物组和反转录病毒整合酶
。
[0014]优选的，所述反转录病毒整合酶包括
Tn5
转座酶
。
[0015]本专利技术还提供了一种诺如病毒的文库构建方法，包括以下步骤：
(1)
提取诺如病毒
RNA
后依次进行预变性和
DNA
去除，得模板液；
[0016](2)
将所述模板液分别与上述诺如病毒特异性反转本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种诺如病毒特异性反转录引物组，其特征在于，包括独立包装的
A
组引物和
B
组引物；所述
A
组引物的核苷酸序列如
SEQ ID No.1
～
SEQ ID No.13
所示；所述
B
组引物的核苷酸序列如
SEQ ID No.14
～
SEQ ID No.25
所示
。2.
一种诺如病毒特异性反转录方法，其特征在于，包括提取诺如病毒
RNA
后依次进行预变性和
DNA
去除，得模板液；将所述模板液分别与权利要求1所述诺如病毒特异性反转录引物组中的
A
组引物和
B
组引物构建反转录体系，进行反转录反应，得
RNA
‑
cDNA
双链；所述反转录体系以
10
μ
L
计，包括：
7.5
μ
L
模板液
、10
×
RTMix 1.0
μ
L、HiScript III Enzyme Mix 1.0
μ
L
和
A
组引物
/B
组引物
0.5
μ
L。3.
根据权利要求2所述诺如病毒特异性反转录方法，其特征在于，所述预变性包括将提取得到的诺如病毒
RNA
于
65℃
加热
5min
，然后在0～
4℃
环境中静置
2min。4.
根据权利要求2或3所述诺如病毒特异性反转录方法，其特征在于，所述反转录反应的程序，包括：
105℃
热盖；
25℃5min
；
37℃30min
；
85℃5s。5.
一种诺如病毒的文库构建试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述诺如病毒特异性反转录引物组和反转录病毒整合酶
。6.
根据权利要求5所述文库构建试剂盒，其特征在于，所述反转录病毒整合酶包括
Tn5
转座酶
。7.
一种诺如病毒的文库构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)
提取诺如病毒
RNA
后依次进行预变性和
DNA
去除，得模板液；
(2)

【专利技术属性】
技术研发人员：张子蕾，刘丹蕾，王祉怡，张静，戴悦，戴雪婷，田相廷，
申请(专利权)人：上海国际旅行卫生保健中心上海海关口岸门诊部，
类型：发明
国别省市：