一种基于三代纳米孔测序检测新型冠状病毒的方法及试剂盒技术

本发明专利技术公开一种基于三代纳米孔测序的新型冠状病毒检测方法及试剂盒

【技术实现步骤摘要】
一种基于三代纳米孔测序检测新型冠状病毒的方法及试剂盒


[0001]本专利技术涉及核酸检测
，具体地涉及一种基于三代纳米孔测序的新型冠状病毒检测方法及试剂盒
。

技术介绍

[0002]基于二代测序或纳米孔测序的目标区域捕获方法在科研和临床检测领域逐渐被广泛应用
。
利用探针捕获并富集目标区域用于深度测序技术由于需要很少的测序数据量，因此能够降低检测成本以及数据分析过程中的计算工作量与计算时间，与全基因组测序相比，仅需相对较低的成本即可获得超高深度的测序数据
。
[0003]杂交捕获的原理是通过人为设计探针与目标区段部分或者全部互补将目标区段捕获，未设计探针区段的片段则会被洗脱丢弃，之后通过变性将探针和被捕获的片段分开进行三代测序文库构建
。
[0004]根据探针的状态不同，杂交捕获又分为固态杂交和液态杂交
。
固态杂交在芯片上设置探针，通过探针将目标区段捕获
。
液态杂交是将探针置于液相中，现有的探针携带生物素，当杂交完成后，通过磁珠可以将探针吸附，随后将未被捕获的片段丢弃，再通过变性将探针和目标片段分开，然后利用磁珠将所有空探针吸附丢弃，捕获完成
。
[0005]目前杂交捕获的缺点之一是常规杂交捕获需要过夜或是杂交捕获过程在4小时以上，导致实验过程较长
。
因此，目前仍亟需一种基于三代纳米孔测序的新型冠状病毒检测方法及试剂盒
。

技术实现思路

[0006]针对现有技术中存在的至少部分问题，专利技术人进行了深入研究，提出一种基于三代纳米孔测序检测新型冠状病毒的方法及试剂盒，通过对磁珠捕获系统组合三代纳米孔测序技术，与无捕获或通过竞品链酶亲和素磁珠结合二代测序的检测相比，具有更稳定的检出率，更优的检测灵敏度，以及高出两个数量级以上的目标序列捕获效率
。
具体地，本专利技术包括以下内容
。
[0007]本专利技术的第一方面，提供一种基于三代纳米孔测序检测新型冠状病毒的方法，其包括以下步骤：
[0008](1)
提供来源于生物样品的核酸片段；
[0009](2)
使用5’
端炔烃修饰的探针通过杂交捕获得到目标序列，基于富集的目标序列构建文库并进行扩增，得到测序用文库，采用三代测序技术对所述文库进行实时单分子测序，得到测序数据；
[0010](3)
对所述测序数据进行分析，从而确定是否存在新型冠状病毒
、
对新型冠状病毒分型和
/
或确定包含所述新型冠状病毒的融合序列
。
[0011]在某些实施方案中，根据本专利技术所述的基于三代纳米孔测序检测新型冠状病毒的方法，其中，所述生物样品包括咽拭子
、
鼻拭子
、
痰液和肺泡灌洗液中的至少一种
。
[0012]在某些实施方案中，根据本专利技术所述的基于三代纳米孔测序检测新型冠状病毒的方法，其中，所述核酸片段长度为1‑
10k。
[0013]在某些实施方案中，根据本专利技术所述的基于三代纳米孔测序检测新型冠状病毒的方法，其中，用于所述杂交捕获的探针以新型冠状病毒全基因组序列作为设计区域
。
[0014]在某些实施方案中，根据本专利技术所述的基于三代纳米孔测序检测新型冠状病毒的方法，其中，用于杂交捕获过程中使用的杂交缓冲液包括：
20x SSPE、10x Denhardt
’
s solution、10mM EDTA、0.2
％ SDS、0.1
％ Tween 20、Cot
‑
1 DNA 5
μ
g、20U RNase
抑制剂
、
杂交增强剂
。
[0015]在某些实施方案中，根据本专利技术所述的基于三代纳米孔测序检测新型冠状病毒的方法，其中，所述探针的长度为
100
‑
150nt。
[0016]在某些实施方案中，根据本专利技术所述的基于三代纳米孔测序检测新型冠状病毒的方法，其中，所述杂交捕获为纳米磁珠杂交捕获
。
[0017]在某些实施方案中，根据本专利技术所述的基于三代纳米孔测序检测新型冠状病毒的方法，其中，所述分析包括将测序数据中的读段与新冠病毒全基因组序列比对分析的步骤
。
[0018]在某些实施方案中，根据本专利技术所述的基于三代纳米孔测序检测新型冠状病毒的方法，其中，所述分析还包括确定捕获效率的步骤
。
[0019]本专利技术的第二方面，提供一种基于三代纳米孔测序检测新型冠状病毒的试剂盒，其包括：
[0020]I.
纳米磁珠偶联物，其包括探针和与其通过连接臂连接的微球；
[0021]II.
杂交缓冲液，其包括：
20x SSPE、10x Denhardt
’
s solution、10mM EDTA、0.2
％ SDS、0.1
％ Tween 20、Cot
‑
1 DNA5
μ
g、20U RNase
抑制剂
、
杂交增强剂；
[0022]III.
清洗液，其包括：
0.1x SSC、0.1
％ SDS、0.1
％ Tween 20
；和
[0023]IV.
扩增试剂和接头引物；
[0024]其中，所述探针设计为能够与靶序列结合并富集获得目标序列，且所述探针以新型冠状病毒全基因组序列作为设计区域
。
[0025]本专利技术通过纳米磁珠捕获试剂在临床样本总核酸构建的纳米孔测序文库中，对低丰度目标序列杂交捕获，采用了优化后的杂交试剂方案和纳米级磁珠的特性，使得常规需要过夜或4小时以上的杂交捕获过程在半小时就可以快速完成，显著缩短了检测流程和时间，并且杂交效果与常规过夜杂交一致
。
纳米磁珠的表面修饰设计和偶联方式显著降低非目标核酸背景的吸附，可以显著提高信噪比，优化低丰度目标检测下限；由于现有链酶亲和素磁珠表面修饰蛋白分子导致非特异性吸附背景高，且探针结合热稳定性也低于本专利技术的纳米磁珠系统
。
[0026]另外，本专利技术通过杂交捕获，将目标核酸序列进行富集减少取样时的偏差，提高检测的稳定性，多次重复实验均可以稳定检出低丰度目标序列，有效避免了漏检和假阴性；同时通过测序，可以获得目标区域核酸序列信息
。
在杂交捕获探针设计中，对目标区域全覆盖并增加了
GC
含量偏离区域的探针覆盖度，大大提高了低丰度目标序列整体的捕获效率和均一性
。
[0027]本专利技术的纳米磁珠对后续酶反应有很好的兼容性，不影响酶的活性或扩增反应产物检测，不需要从磁珠上洗脱目标序列再进行扩增，避免了过度损耗低拷贝目标序列和检
测偏差，可以实现捕获后直接磁本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种基于三代纳米孔测序检测新型冠状病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)
提供来源于生物样品的核酸片段；
(2)
使用5’
端炔烃修饰的探针通过杂交捕获得到目标序列，基于富集的目标序列构建文库并进行扩增，得到测序用文库，采用三代测序技术对所述文库进行实时单分子测序，得到测序数据；
(3)
对所述测序数据进行分析，从而确定是否存在新型冠状病毒
、
对新型冠状病毒分型和
/
或确定包含所述新型冠状病毒的融合序列
。2.
根据权利要求1所述的基于三代纳米孔测序检测新型冠状病毒的方法，其特征在于，所述生物样品包括咽拭子
、
鼻拭子
、
痰液
、
肺泡灌洗液，或来源于动物模型的组织或细胞
。3.
根据权利要求2所述的基于三代纳米孔测序检测新型冠状病毒的方法，其特征在于，所述核酸片段长度为1‑
10k。4.
根据权利要求3所述的基于三代纳米孔测序检测新型冠状病毒的方法，其特征在于，用于所述杂交捕获的探针以新型冠状病毒全基因组序列作为设计区域
。5.
根据权利要求4所述的基于三代纳米孔测序检测新型冠状病毒的方法，其特征在于，所述探针的长度为
100
‑
150nt。6.
根据权利要求5所述的基于三代纳米孔测序检测新型冠状病毒的方法，其特征在于，所述杂交捕获为纳米磁珠杂交捕获
。7.
根据权利要求6所述的基于三代纳米孔测序检测新型冠状病毒的方法，其特征在于，所述分析包括将测序数据中的读段与新冠病毒全基因组序列比对分析的步骤
。8.
...

【专利技术属性】
技术研发人员：请求不公布姓名，
申请(专利权)人：伟博基因科技天津有限公司，
类型：发明
国别省市：