用于多酶级联催化合成制造技术

本发明专利技术属于生物技术和酶工程领域，具体公开了一种多酶级联催化合成

【技术实现步骤摘要】
用于多酶级联催化合成GDP
‑
L
‑
岩藻糖的生物酶组合物及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物技术和酶工程领域，特别涉一种多酶级联催化合成
GDP
‑
L
‑
岩藻糖的方法，具体为重组大肠杆菌表达载体的构建及转化方法
、
蛋白表达及纯化方法
、
酶活性测定和
GDP
‑
L
‑
岩藻糖制备方法
。

技术介绍

[0002]母乳作为婴儿的最佳食物来源，除了为婴儿提供最基本的营养外，还富含大量对婴幼儿的健康发育有着积极影响的活性物质
。
其中，人乳寡糖
(HMOs)
是母乳中仅次于乳糖和脂肪的第三大固体成分，母乳中的寡糖含量是其它动物乳汁的上百倍，如是牛乳的
100
‑
300
倍
。
现如今已发掘
200
多种
HMOs
，主要分为岩藻糖基化寡糖和唾液酸化寡糖，其中岩藻糖基化寡糖占
77
％，唾液酸化寡糖占
28
％
。
而岩藻糖基化寡糖中岩藻糖基乳糖
(FL)
的含量最高，占据
HMOs
总量的
36
％，在母乳中的浓度为
0.5
‑
3g/L。
作为母乳中含量最丰富的功能性低聚糖
。FL
具有益生元<br/>、
抗感染
、
免疫调节以及促进婴幼儿大脑发育等重要生理功能，在婴幼儿的免疫力改善
、
肠道疾病预防
、
智力发育等领域效果明显
。
[0003]FL
的合成需要
GDP
‑
岩藻糖作为前体，
GDP
‑
岩藻糖的前体是
L
‑
岩藻糖
。L
‑
岩藻糖可以通过化学合成，如从
D
‑
半乳糖
、L
‑
阿拉伯糖
、D
‑
甘露糖或
D
‑
半乳糖醛酸开始合成
L
‑
岩藻糖，比较而言
D
‑
半乳糖是制造
L
‑
岩藻糖的最合适原料
。
但化学合成常常要求选择性技术的诸多保护
/
脱保护步骤使这些方法变得冗长而繁重；另外，化学合成需要进行费力的色谱分离以使中间物与副产物分离，得率低
、
成本高，限制了其在
L
‑
岩藻糖制备方面的应用
。
目前岩藻糖的来源主要是天然提取，通过萃取而从生物质如从藻类中分离出包含岩藻糖的寡糖，寡糖经水解后产生含岩藻糖以及相关糖类和
/
或其衍生物的复杂混合物，再从混合物中通过离子交换层析
、
透析
、
分步结晶等方法纯化回收岩藻糖，但这样获取的岩藻糖价格高昂
。
目前人工制备
FL
时使用的岩藻糖主要用细胞转化的方法，但成本较高，因此仍然迫切需要提供可以增加扩大规模的机会并促进产生低成本方法的替代性
L
‑
岩藻糖合成路径
。
采用酶促合成可以解决成本高昂的问题，最为重要的是如何快速获得大量廉价的
GDP
‑
岩藻糖，以实现人工规模化制备岩藻糖基化寡糖
。

技术实现思路

[0004]为了解决上述问题，本专利技术提供了一种生物酶催化合成
GDP
‑
岩藻糖的方法，以获得低成本
、
高纯度
GDP
‑
岩藻糖的方法，为岩藻糖基乳糖的合成提供重要的原料
。
[0005]生物酶组合物及其相关生物材料在制备
GDP
‑
岩藻糖中的应用，所述生物酶组合物包括蔗糖合酶
(SlSUS)、CDP
‑
泰威糖2‑
差向异构酶
(SeC2E)、GDP
‑
甘露糖脱水酶
(SeGMD)
和异构还原酶
(SeGER)
；
[0006]所述蔗糖合酶
(SlSUS)
来源于番茄
(Solanum locopersicum)
，氨基酸序列的
GenBank
序列号为
NP_001234655
；
[0007]所述
CDP
‑
泰威糖2‑
差向异构酶
(SeC2E)
来源于肠道沙门氏菌
(Salmonella enterica)
，氨基酸序列的
GenBank
序列号为
DW4091412.1
；
[0008]所述
GDP
‑
甘露糖脱水酶
(SeGMD)
来源于肠道沙门氏菌
(Salmonella enterica)
，氨基酸序列的
GenBank
序列号为
ACN45760.1
；
[0009]所述异构还原酶
(SeGER)
来源于肠道沙门氏菌
(Salmonella enterica)
，氨基酸序列的
GenBank
序列号为
WP_001041701.1。
[0010]其中，所述相关生物材料为表达所述生物酶组合物中各酶的核酸分子，或含有所述核酸分子的表达盒
、
重组载体
、
重组菌或重组细胞
。
[0011]其中，所述重组菌为向所述宿主菌中导入能够表达述蔗糖合酶
、CDP
‑
泰威糖2‑
差向异构酶
、GDP
‑
甘露糖脱水酶和异构还原酶的核酸分子，经诱导培养后获得表达所述述蔗糖合酶
、CDP
‑
泰威糖2‑
差向异构酶
、GDP
‑
甘露糖脱水酶和异构还原酶的重组菌；所述重组细胞为向所述宿主细胞中导入能够表达述蔗糖合酶
、CDP
‑
泰威糖2‑
差向异构酶
、GDP
‑
甘露糖脱水酶和异构还原酶的核酸分子，经诱导培养后获得表达所述述蔗糖合酶
、CDP
‑
泰威糖2‑
差向异构酶
、GDP
‑
甘露糖脱水酶和异构还原酶的重组细胞
。
[0012]上述的生物酶组合物或相关生物材料也应在本专利技术的保护范围之内
。
[0013]本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
生物酶组合物在制备
GDP
‑
岩藻糖中的应用，所述生物酶组合物包括蔗糖合酶
、CDP
‑
泰威糖2‑
差向异构酶
、GDP
‑
甘露糖脱水酶和异构还原酶；所述蔗糖合酶来源于番茄
(Solanum locopersicum)
，氨基酸序列的序列号为
NP_001234655
；所述
CDP
‑
泰威糖2‑
差向异构酶来源于肠道沙门氏菌
(Salmonella enterica)
，氨基酸序列的序列号为
DW4091412.1
；所述
GDP
‑
甘露糖脱水酶来源于肠道沙门氏菌
(Salmonella enterica)
，氨基酸序列的序列号为
ACN45760.1
；所述异构还原酶来源于肠道沙门氏菌
(Salmonella enterica)
，氨基酸序列的序列号为
WP_001041701.1。2.
与生物酶组合物相关的生物材料在制
GDP
‑
岩藻糖中的应用，其特征在于，所述生物材料为如下任一所示：
A1)
编码权利要求1所述的蔗糖合酶
、CDP
‑
泰威糖2‑
差向异构酶
、GDP
‑
甘露糖脱水酶或者异构还原酶的核酸分子，
A2)
含有所述核酸分子的表达盒，
A3)
含有所述核酸分子的重组载体，
A4)
含有所述核酸分子的重组菌，
A5)
含有所述核酸分子的重组细胞
。3.
根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述重组菌为向所述宿主菌中导入能够表达述蔗糖合酶
、CDP
‑
泰威糖2‑
差向异构酶
、GDP
‑
甘露糖脱水酶和
/
或异构还原酶的核酸分子，经诱导培养后获得表达所述述蔗糖合酶
、CDP
‑
泰威糖2‑
差向异构酶
、GDP
‑
甘露糖脱水酶和
/
或异构还原酶的重组菌；所述重组细胞为向所述宿主细胞中导入能够表达述蔗糖合酶
、CDP
‑
泰威糖2‑
差向异构酶
、GDP
‑
甘露糖脱水酶和
/
或异构还原酶的核酸分子，经诱导培养后获得表达所述述蔗糖合酶
、CDP
‑
泰威糖2‑
差向异构酶
、GDP
‑
甘露糖脱水酶和
/
或异构还原酶的重组细胞
。4.
权利要求1‑3任一中所述的生物酶组合物或相关生物材料
。5.
一种多级多酶级联催化合成
GDP
‑
岩藻糖的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)
以鸟苷二磷酸和蔗糖为底物，经权利要求1中所述的蔗糖合酶催化反应生成
GDP
‑
葡萄糖；
2)
以

【专利技术属性】
技术研发人员：田愉，石波，约瑟夫，
申请(专利权)人：北京国科星联科技有限公司，
类型：发明
国别省市：