一种抗体亲和力高通量筛选方法技术

本发明专利技术公开了一种抗体亲和力高通量筛选方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

【技术实现步骤摘要】
一种抗体亲和力高通量筛选方法


[0001]本专利技术属于生物
，涉及一种抗体亲和力的高通量筛选方法
。

技术介绍

[0002]单克隆抗体在科研
、
疾病诊断及治疗等方面具有重要的作用
。
目前发现单克隆抗体的主流技术手段依然是杂交瘤技术，且杂交瘤来源的单克隆抗体的重链和轻链是原始
B
细胞天然配对的，其分泌的单克隆抗体是天然的
IgG
分子形式，所以即使在基因工程抗体技术发展非常成熟的今天，杂交瘤技术仍然具有不可替代的作用
。
杂交瘤技术最关键的技术环节是细胞筛选，如何快速
、
高效地从成千上万的杂交瘤细胞里面筛选到能够分泌特异性抗体且性能优良的克隆，是杂交瘤
一直在努力解决的首要技术难题，而抗体亲和力是评价抗体性质和质量的重要指标，它反应了抗体和抗原之间的结合牢固程度，对抗体的筛选具有重要的指导作用
。
[0003]目前，测定受体配体间的亲和力即解离平衡常数的方法主要有3种：热力学测定方法
、
动力学测定方法以及平衡浓度测定法，其中动力学测定方法和平衡浓度测定法较为常用，2种方法均可对直接对
96
微孔板培养上清中的抗体进行亲和力的测定，但各有优劣
。
动力学检测方法主要借助于昂贵分析仪器
(
如
FortebioBiacore)
，该方法高灵敏度高，亲和力测定范围广且方法稳定，能够得到动力学参数
、K
on
和
K
off
，但仪器成本和维护成本较高，适合做最终的功能学评价和质量表征，很少应用到
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微孔板的高通量初筛阶段
。
动态平衡测定法无需昂贵设备投入，样品无需标记和纯化，适合初筛
。
竞争
Elisa
一般进行8点以上梯度稀释，将各浓度下抗体
、
抗原以及反应生成抗体
‑
抗原复合物混合反应后，检测复合物的信号值，绘制四参数反
S
型曲线，得到
IC50
值，从而鉴定样品亲和力的大小，但该方法操作过程相对繁琐，通量也较低，一般在短时间内很难实现几百个样品亲和力的筛选工作，而成团的杂交瘤细胞生长速率却很快，从占
96
孔板
1/8
左右面积
(
开始检测
)
到细胞开始大量死亡大概3‑4天时间，如此短的时间既要完成大量杂交瘤细胞样品阳性与否的判断，又要完成亲和力高低的鉴定，传统动态平衡测定法几乎无法实现，所以目前杂交瘤细胞
96
孔板筛选阶段，主要还是靠阳性与否进行筛选，这必然给后期亲和力鉴定工作带来了巨大压力
。
[0004]因此，如何建立一种方便快捷且廉价通用的抗体亲和力高通量筛选策略，以实现高亲和力单克隆抗体的高效筛选，是单克隆抗体领域亟需解决问题之一
。

技术实现思路

[0005]针对现有技术的不足和实际需求，本专利技术提供一种抗体亲和力高通量筛选方法，利用抗体
Elisa
检测
S
型曲线特定区间的变化趋势，快速筛选高亲和力抗体，弥补了现有技术中传统竞争
Elisa
法通量低而精密仪器检测成本高的技术缺陷
。
[0006]为达上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0007]本专利技术提供一种抗体亲和力的高通量筛选方法，所述方法包括以下步骤：
[0008](1)
将抗体样品进行梯度稀释，进行
Elisa
检测，以稀释倍数为横坐标，检测信号值
为纵坐标，进行线性拟合，根据线性回归决定系数
R2，
R2≥95
％，确定线性拟合直线的斜率
k
；
[0009](2)
根据线性拟合直线的斜率
k
的绝对值
|k|
进行筛选，
|k|
值越小，亲和力越高
。
[0010]本专利技术发现，利用动态平衡测定法
(
饱和浓度法
)
对纯化后的抗体进行亲和力检测时，会有明显的四参数
S
型曲线，即随抗体浓度渐进变化的信号曲线，在抗体低浓度和高浓度时有明显的上下平台期，
Elisa
四参数
S
型曲线与微生物生长曲线类似，方便描述，我们将
Elisa
四参数
S
型曲线也分为“迟缓区”、“对数区”、“稳定区”和“衰亡区”。
在对
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微孔板样品进行
Elisa
检测时，检测信号值主要受2个因素的影响，一是孔内抗体自身亲和力的大小，二是孔内抗体浓度的大小
。
当抗体浓度足够高时，即便抗体亲和力很低，依然能检测到强信号值，因此，该部分数据
(
衰亡区
)
无法真实指导亲和力大小的判断；当抗体浓度足够低时，即便抗体亲和力很高，检测信号依然较弱，该部分数据
(
迟缓区
)
也无法真实指导亲和力大小的判断；而四参数
S
型曲线“对数区”有一段是线性的，该部分检测信号会随抗体浓度的变化而线性变化，该部分抗体浓度处于一个合适状态，能真实反应抗体与抗原的结合状态，检测信号能正常指导亲和力大小的判断
。
[0011]由于抗原和抗体结合反应是一个可逆反应，最终的结果是达到抗原
、
抗体和抗原
‑
抗体复合物三者共存的状态
。
而亲和力则是这个相对状态的特征参数，即解离平衡常数
KD。
常规结合
Elisa
检测时，处于“对数区”浓度范围内的抗体，亲和力越高，与酶标板上抗原的结合程度会更强，同浓度下
Elisa
检测到的信号也会更强；本专利技术发现，将“对数区”浓度范围内的抗体进行梯度稀释后再进行
Elisa
时，亲和力高的抗体，检测信号下降的速率会明显低于亲和力低的抗体，基于此，本专利技术提供了一种高亲和力抗体的筛选方法，无需借助昂贵设备即可实现样品的高通量筛选，操作简单，高效快捷，且准确率高
。
[0012]优选地，所述梯度稀释为梯度稀释4～8个不同浓度
(
例如可以是
5、6
或
7)
，稀释倍数范围为
10
～
5000
倍
(
例如可以是
11、12、13、15、20、50、100、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、4600、4700、4800
或
4900)。
[0013]优选地，步骤
(2本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种抗体亲和力高通量筛选方法，其特征在于，所述抗体亲和力高通量筛选方法包括以下步骤：
(1)
将抗体样品进行梯度稀释，进行
Elisa
检测，以稀释倍数为横坐标，检测信号值为纵坐标，进行线性拟合，根据线性回归决定系数
R2，
R2≥95
％，确定拟合直线的斜率
k
；
(2)
根据拟合直线的斜率
k
的绝对值
|k|
进行筛选，
|k|
值越小，抗体亲和力越高
。2.
根据权利要求1所述的抗体亲和力高通量筛选方法，其特征在于，所述梯度稀释为梯度稀释4～8个不同浓度，稀释倍数范围为
10
～
5000
倍
。3.
根据权利要求1所述的抗体亲和力高通量筛选方法，其特征在于，步骤
(2)
所述筛选包括将
|k|
值从小到大排序，筛选
|k|
值前
30
％的抗体
。4.
根据权利要求1所述的抗体亲和力高通量筛选方法，其特征在于，所述方法还包括利用步骤
(1)
和步骤
(2)
计算高亲和力阳性对照抗体对应斜率的绝对值
|k0|
，根据
|k0|
进行筛选
。5.
根据权利要求4所述的抗体亲和力高通量筛选方法，其特征在于，所述高亲和力阳性对照抗体为与待筛选抗体结合抗原相同且亲和力已知的抗体，抗体亲和力常数不高于
10
‑9M。6.
根据权利要求4所述的抗体亲和力高通量筛选方法，其特征在于，所述高亲和力阳性对照抗体的起始浓度为
1ng/mL
～1μ
g/mL。7.
根据权利要求4所述的抗体亲和力高通量筛选方法，其特征在于，所述根据
|k0|
进行筛...

【专利技术属性】
技术研发人员：代军军，黄瑞晶，李文蕾，王莎莎，李剑，曹小丹，王根辈，陈妍，李铭宇，纪海姣，徐骁，于妍，孙伟，
申请(专利权)人：天士力生物医药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：