一种酮还原酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种酮还原酶突变体及其应用，所述的突变体在如

【技术实现步骤摘要】
一种酮还原酶突变体及其应用


本专利技术涉及基因工程和生物酶催化
，具体涉及一种酮还原酶及其应用
。

技术介绍

酮还原酶普遍存在于自然界动
、
植物和微生物体内
。
其中微生物来源的酮还原酶最为广泛，目前已有至少
200
种来自微生物的酮还原酶被报道参与多种物质的还原反应
。
酮还原酶在手性醇的合成中具有重要地位，催化活性和立体选择性良好的酮还原酶能够有效地催化手性醇的不对称合成，极大地提高手性醇的合成效率，简化产物制备和分离流程，如阿托伐他汀
、
杜洛西汀
、
替格瑞洛等原料药或其中间体都已采用酮还原酶法进行制备，减少了很多金属手性催化剂或拆分剂的使用，酮还原酶已经成为医药化工领域应用最广泛的酶
。
酮还原酶是依赖
NAD(H)
或
NADP(H)
为辅酶，能够催化醛或酮可逆还原生成相应醇的一类氧化还原酶
。
酮还原酶共同的分子特征是利用
NAD(H)
或
NADP(H)
为辅酶，辅酶结合区域位于
N
‑
端
Rossmann
折叠中，保守位点为
Gly
富集序列
G
‑
x
‑
x
‑
x
‑
G
‑
x
‑
G。
催化结构域位于
N/>‑
端中部，保守的催化三联体为
Ser
‑
Tyr
‑
Lys。
该家族的酶一般由单体
、
二聚体或四聚体组成，单亚基含有
250
个左右的氨基酸，在手性醇合成过程中起到了重要的作用
。
[0003]角鲨胺
(squalamine)
，又名
(3
β
,5
α
,7
α
)
‑3‑
[[3
‑
((4
‑
氨基丁基
)
氨基
)
丙基
]氨基
]胆甾烷
‑
7,24
‑
二醇
‑
24
‑
磺酸酯，最初是
Zasloff
及其合作者从白斑角鲨肝脏中提取获得了一种海洋氨基甾醇类化合物，角鲨胺具有很强的广谱抗菌作用和抗血管生成效应
。
[0004]传统的角鲨胺合成工艺主要以3β
‑
羟基
‑5‑
胆烯酸
、
鹅去氧胆酸
、
岩藻甾醇
、
脱氢表雄酮或醋酸娠烯醇酮等为原料
。
如以鹅去氧胆酸甲酯为原料通过化学合成制备角鲨胺需要经过九步反应
(Dong
‑
Hui Zhang,Feng Cai,Xiang
‑
Dong Zhou,et al.Aconcise and stereoselective synthesis of squalamine.Organic Letters,2003,5(18):3257
‑
3259.)
，在这一合成过程中，其关键就是构建
24
位手性羟基中间体
。
这一反应路线需要将
C
‑7位羟基用
MOMO
保护，这是一种具有高毒性和致癌性的试剂，
C
‑
24
位经手性试剂化合物的控制对化合物进行亲核加成得到
R
构型的羟基
。
手性试剂和二异丙基锌均为价格昂贵的试剂，合成成本极其高，需要研究人员寻找更好的替代制备方法
。
专利
202310759919.8
公开了采用化学
‑
酶方法制备3α
,7
α
,24R
‑
三羟基
‑5α
‑
胆甾醇的方法
。
该方法具有很强的先进性，但是该方法使用的酮还原酶
KRED
‑
101
，
KRED
‑
171
及其突变体中的一种或多种，转化效率仅可以达到
64
％
。

技术实现思路

本专利技术针对上述技术难题，提供了一种酮还原酶突变体，利用酮还原酶
(NaKRED)
为模板进行生物酶催化剂的改进
。
该突变体具有更高的活性和选择性，能够结合
NADH
再生还原系统将甾体化合物
(1a)
选择性还原，得到
24R
‑
羟基构型的胆甾醇
(1b)
，并能够提高转化效率
。
本专利技术的技术方案如下：本专利技术所提供的酮还原酶突变体可以在
NADH
再生系统下能够催化
1a
一步生成
1b
，酶促转化反应式如图
1。
为达到专利技术的目的，本专利技术以已知的酮还原酶经过筛选，获得来自
Novosphingobium aromaticivorans
的具有立体选择的酮还原酶
(NaKRED)
为模板，通过研究酮还原酶的结合口袋，构建了突变体，能够实现
1a
生物酶催化转化生成
1b
，如
SEQ ID NO.2
所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸位点突变且具有选择性还原
24
位羰基的活性
。
一种酮还原酶突变体，所述的突变体在如
SEQ ID NO.2
所示氨基酸序列基础上经过氨基酸突变得到，所述突变为
(1)
或
(2)
：
(1)Y199A、Y199C、M196W、A146F、A146L
中任意一种；
(2)Y199A、Y199C、M196W A146F、A146L
中任意一种与
N149L、N149I、I195L
和
I195V
中任意一种的组合
。
优选地，所述突变为如下任意一种组合：
Y199A/N149L、Y199A/N149I、Y199A/I195L、Y199A/I195V。
一种
DNA
分子，编码上述酮还原酶突变体
。
一种重组质粒，含有所述的
DNA
分子
。
根据上述的重组质粒，其载体选自如下任意一种：
pET
‑
21b(+)、pET
‑
22b(+)、pET
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种酮还原酶突变体，其特征在于，所述的突变体在如
SEQ ID NO.2
所示氨基酸序列基础上经过氨基酸突变得到，所述突变为
(1)
或
(2)
：
(1)Y199A、Y199C、M196W、A146F、A146L
中任意一种；
(2)Y199A、Y199C、M196W A146F、A146L
中任意一种与
N149L、N149I、I195L
和
I195V
中任意一种的组合
。2.
根据权利要求1所述的酮还原酶突变体，其特征在于，所述突变为如下任意一种组合：
Y199A/N149L、Y199A/N149I、Y199A/I195L、Y199A/I195V。3.
一种
DNA
分子，其特征在于，编码权利要求1或2所述的酮还原酶突变体
。4.
一种重组质粒，其特征在于，含有权利要求3所述的
DNA
分子
。5.
一种重组菌，其特征在于，含有权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：张雷，孔鹏，李杉，钟义华，
申请(专利权)人：中山市华南理工大学现代产业技术研究院，
类型：发明
国别省市：