一种转氨酶的突变体及其在制备西他列汀中间体生产中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种转氨酶的突变体及其在制备西他列汀中间体生产中的应用，所述突变体是在如

【技术实现步骤摘要】
一种转氨酶的突变体及其在制备西他列汀中间体生产中的应用


[0001]本专利技术属于基因工程领域，主要涉及一种转氨酶的突变体及其在制备西他列汀中间体生产中的应用
。

技术介绍

[0002]西他列汀（
sitagliptin
）是一类抑制二肽基肽酶
‑
4(DPP
‑
4)
的抗高血糖药物之一，通过保护内源性肠降血糖素和增强其作用而控制血糖水平，葡萄糖依赖性促胰岛素释放肽
(GIP)
和胰高血糖素样肽
‑
1(GLP
‑
1)
，是针对膳食摄入而释放的肠降血糖素
。
由于其高效的控糖效果，西他列汀已经在很多国家被批准用于治疗
II
‑
型糖尿病
。
[0003]化学法制备西他列汀的主要方法为烯胺酰胺的不对称氢化，反应所需条件为
250psi
高压的重金属铑催化反应
。
化学制备过程中所需要的高压和重金属不利于工业化绿色生产
。
因此，化学与生物酶的组合制备方法逐步被越来越多生产厂家所采用
。
中国专利
CN102405281
公布了一种转氨酶以及该酶在制备西他列汀中的应用
。
该工艺使用
DMSO
作为底物助溶剂在异丙胺（氨基供体）和辅酶磷酸吡哆醛（
PLP
）的共同作用下，将底物4‑
氧
‑4‑
[3
‑
（三氟甲基）
‑
5,6
二氢
「1,2,4〕
三唑
[4,3
‑
a]吡嗪
‑
7(8H)
‑
基
]‑1‑
(2,4,5
‑
三氟苯基）丁
‑2‑
酮
(
以下简称为：酮酰胺底物
)
转化为
2R
‑4‑
氧
‑4‑
T3
‑
（三氟甲基）
‑
5,6
‑
二氢
[1,2,4]三唑
[4,3
‑
a]吡嗪
‑
7(8H)
‑
基
]‑1‑
(2,4,5
‑
三氟苯基）丁
‑2‑
胺
(
以下简称为：产物
)。
然而，在实际生产中，该工艺所采用的
DMSO
对酶损伤较大，且难以回收，导致生产成本过高，不利于工业化大生产
。
[0004]因此，本领域迫切需要开发一种能在可回收溶剂中具有高催化活力，并能降低生产成本的生物催化方法
。
具体的，需要开发一种利用在甲醇溶剂中高效催化底物转化为产物的酶制备西他列汀的方法
。

技术实现思路

[0005]本专利技术是针对目前反应体系以
DMSO
为溶剂，价格高，使用后无法回收，而转氨酶在甲醇中活性较低的问题，对转氨酶进行突变，得到能够在甲醇溶剂中制备西他列汀的突变体
。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为：一种转氨酶突变体，所述突变体是在如
SEQ ID NO:2
所示转氨酶的氨基酸序列的基础上发生突变的氨基酸序列，所述突变位点为第
10
位
、28
位
、271
位中任意单点或多点突变
。
[0007]突变体是在如
SEQ ID NO:2
所示转氨酶的氨基酸序列的第
10
位由异亮氨酸突变为天冬酰胺，命名为
I10N
突变酶，其氨基酸序列如
SEQ ID NO:3
所示
。
[0008]突变体是在如
SEQ ID NO:2
所示转氨酶的氨基酸序列的第
28
位由亮氨酸突变为甘氨酸，命名为
L28G
突变酶，其氨基酸序列如
SEQ ID NO:5
所示
。
[0009]突变体是在如
SEQ ID NO:2
所示转氨酶的氨基酸序列的第
271
位由谷氨酸突变为天冬氨酸，命名
E271D
突变酶，其氨基酸序列如
SEQ ID NO:7
所示
。
[0010]突变体是在如
SEQ ID NO:2
所示转氨酶的氨基酸序列的第
10
位由异亮氨酸突变为天冬酰胺
、
第
28
位由亮氨酸突变为甘氨酸且第
271
位由谷氨酸突变为天冬氨酸，命名为
I10N/L28G/E271D
突变酶，其氨基酸序列如
SEQ ID NO:8
所示
。
[0011]一种表达基因，该基因编码所述的转氨酶突变体
。
[0012]一种重组质粒，该重组质粒连接有所述的表达基因
。
[0013]一种重组细胞，该重组细胞包含有上述重组表达质粒或上述转氨酶突变体的表达基因
。
[0014]转氨酶突变体表达载体的构建：
PCR
扩增转氨酶突变体基因序列，使用
0.9%
的琼脂糖凝胶进行核苷酸电泳，待条带清晰出现后，对大小为
1000bp
左右的目标条带进行胶条割胶，使用胶回收试剂盒（宝生物公司）回收目标
DNA
片段，并接着按照宝生物公司（网址：
www.takara.com.cn
）
2009
版产品目录说明书描述的方法，将所获得的
DNA
片段和载体
pET28b+
（
Novagen
公司）用限制性内切酶
NdeI
和
XhoI
进行双酶切
。
[0015]酶切产物再次进行电压为
100
伏的
DNA
电泳，回收相应大小为
1000bp
和
5300bp
左右的片段和载体，最后将片段和载体按照
3:1
的比例混合后，加入
1.5
单位的
T4
连接酶，
16℃
连接
12
小时
。
连接反应结束后，将连接产物转化大肠杆菌
DH5
‑
alpha
感受态细胞，在含有卡那霉素的
LB
平板上筛选阳性克隆，经过
NdeI
和
XhoI
双酶切和
DNA
测序验证，获得包含有大小为...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种转氨酶突变体，其特征在于，所述突变体是在如
SEQ ID NO:2
所示转氨酶的氨基酸序列的基础上发生突变的氨基酸序列，所述突变位点为第
10
位
、28
位
、271
位中任意单点或多点突变
。2.
根据权利要求1所述的转氨酶突变体，其特征在于，突变体是在如
SEQ ID NO:2
所示转氨酶的氨基酸序列的第
10
位由异亮氨酸突变为天冬酰胺
。3.
根据权利要求1所述的转氨酶突变体，其特征在于，突变体是在如
SEQ ID NO:2
所示转氨酶的氨基酸序列的第
28
位由亮氨酸突变为甘氨酸
。4.
根据权利要求1所述的转氨酶突变体，其特征在于，突变体是在如
SEQ ID NO:2
所示转氨酶的氨基酸序列的第
271
位由谷氨酸突变为天冬氨酸
。5.
根据权利要求1所述的转氨酶突变体，其特征在于，突变体是在如
SEQ ID NO:2
所示转氨酶的氨基酸序列的第
10
位由异亮氨酸突变为天冬酰胺
、
第
28
位由亮氨酸突变为甘氨酸且第
271
位由谷氨酸突变为天冬氨酸
。6.
一种...

【专利技术属性】
技术研发人员：余宏，王波，钱晓东，陈涛，
申请(专利权)人：苏州诺恩斯生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：