一种制造技术

本发明专利技术属于有机复合材料技术领域，具体涉及一种

【技术实现步骤摘要】
一种DNA逻辑门纳米器件在细胞表面蛋白染色中的应用


[0001]本专利技术属于有机复合材料
，具体涉及一种
DNA
逻辑门纳米器件在细胞表面蛋白染色中的应用
。

技术介绍

[0002]利用抗原抗体之间的特异性识别结合，以及酶联二抗催化显色底物沉积的免疫组织化学
(IHC)
技术已被广泛用于蛋白质原位染色分析
。IHC
技术依靠一抗对靶标蛋白的识别，引入过氧化物酶
(HRP)
偶联二抗，催化
3,3
’‑
二氨基联苯胺
(DAB)
的氧化，使其沉积在细胞膜表面，从而对目标蛋白进行显色
。
然而，免疫组化只能评估蛋白质的表达水平，不能反应蛋白之间的相互作用和聚集状态，不利于个性化治疗的实施
。
[0003]核酸适配体是通过体外富集筛选得到的蛋白质高特异性亲和核酸序列，因其与靶标物质的结合能力可与抗体媲美，被称作“化学抗体”。
基于
DNA
碱基之间的互补配对原则，可以设计组装复杂的二维
、
三维
DNA
结构，进而开发出具有特定功能的
DNA
逻辑门纳米器件
。
通过
DNA
逻辑门纳米器件整合两个或多个核酸适配体，可以将核酸适配体对不同蛋白质靶标的识别信息转换为串联或并联输出信号，从而对细胞膜表面的蛋白质相互作用进行识别
(J.Am.Chem.Soc.2018,140(31),9793
‑
9796
；
Chem.Rev.2021,121(22),13797
‑
13868)。
此外，在
DNA
逻辑门器件中引入
G
‑
四链体
/Hemin
，利用其
HRP
仿酶活性对显色底物的催化，可以将识别信号转换为显色信息
(Angew.Chem.,Int.Ed.2021,60(40),21673
‑
21678.)。
然而，显色产物在溶液中的随机扩散使其输出信号只能代表靶标蛋白的表达水平，而无法对靶标进行原位分析
。
[0004]G
‑
四链体是由
G
‑
四分体平面通过
π
‑
π
堆积形成的四股螺旋核酸结构，每一层的
G
‑
四分体是由4个鸟嘌呤核苷酸通过
Hoogteen
氢键连接而成
。
申请号为
CN2021106103891
，专利技术名称为“一种新型半醌自由基纳米材料及其制备方法与应用”的专利公开了一种将含有连续
G
序列的核酸退火复性，得到含
G
‑
四链体的水溶液，然后再在该水溶液中加入血红素得到
G
‑
四链体
/Hemin
复合物的方法
。
该专利发现部分聚多巴胺可以通过
π
‑
π
堆积插入
G
‑
四分体的
π
平面之间，剩余的聚多巴胺则就可以将
G
‑
四链体粘附在一起
。
由于
G
‑
四链体之间存在静电斥力，因此
G
‑
四链体无法纵向堆叠，最终横向排列形成纳米片形貌的聚合物
。
如果只是将这种形貌的
G
‑
四链体
/Hemin
复合物引入
DNA
逻辑门器件中，利用聚多巴胺在
G
‑
四链体上的附着作为显色剂，则会存在催化位点少，显色程度低的问题，不利于染色结果的观察
。
[0005]综上所述，有必要提出一种新的方法和策略，以弥补现有技术方案的不足
。

技术实现思路

[0006]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种利用
DNA
逻辑门纳米器件对细胞表面蛋白进行原位染色的方法和应用，具体技术方案如下
。
[0007]：一种利用
DNA
逻辑门纳米器件对细胞表面蛋白进行原位染色的方法，包括以下步骤：
[0008]步骤1：通过
DNA
自组装反应合成
DNA
纳米三棱柱，将触发序列
、
靶蛋白核酸适配体序列与所述
DNA
纳米三棱柱共孵育，构建出
DNA
逻辑门纳米器件，所述触发序列的核苷酸序列如
SEQID.NO.5
所示；
[0009]步骤2：加入互补序列，所述互补序列与步骤1构建的
DNA
逻辑门纳米器件上的触发序列以及靶蛋白核酸适配体序列结合，将所述触发序列和靶蛋白核酸适配体序列暂时封闭；
[0010]步骤3：培养细胞，将细胞与步骤2中的
DNA
逻辑门纳米器件共孵育，当细胞膜表面存在靶蛋白时，所述靶蛋白核酸适配体序列与靶蛋白结合
(
释放互补序列
)
，触发逻辑门运算以使所述触发序列暴露；
[0011]步骤4：在步骤3的反应体系中进一步加入发夹序列孵育，所述发夹序列与所述触发序列结合，使结合在靶蛋白上的
DNA
逻辑门纳米器件顶端形成
G4
纳米线结构，所述发夹序列的核酸序列如
SEQID.NO.2
～4所示；
[0012]步骤5：在步骤4的反应体系中进一步加入血红素；
[0013]步骤6：在步骤5的反应体系中一步加入多巴胺
(
无色
)
和
H2O2，室温孵育
10
‑
120min
，形成黑色聚多巴胺纤维，从而对细胞膜表面靶蛋白显色
。
[0014]进一步，所述细胞膜表面靶蛋白为蛋白质二聚体
。
[0015]进一步，所述蛋白质二聚体为
HER2:HER3
异二聚体，其适配体核苷酸序列如
SEQ ID NO.6
～7所示
。
[0016]进一步，所述互补序列包括第1互补序列
、
第2互补序列
、
第3互补序列和第4互补序列，所述互补序列的核苷酸序列如
SEQ ID NO.8
‑
11
所示
。
[0017]进一步，所述步骤4中加入发夹序列的孵育时间为1‑
2h。
[0018]进一步，所述
DNA
逻辑门纳米器件的摩尔浓度为
10
‑
100nM。
[0019]进一步，所述
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种利用
DNA
逻辑门纳米器件对细胞表面蛋白进行原位染色的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：通过
DNA
自组装反应合成
DNA
纳米三棱柱，将触发序列
、
靶蛋白核酸适配体序列与所述
DNA
纳米三棱柱共孵育，构建出
DNA
逻辑门纳米器件，所述触发序列的核苷酸序列如
SEQID.NO.5
所示；步骤2：加入互补序列，所述互补序列与步骤1构建的
DNA
逻辑门纳米器件上的触发序列以及靶蛋白核酸适配体序列结合，将所述触发序列和靶蛋白核酸适配体序列暂时封闭；步骤3：培养细胞，将细胞与步骤2中的
DNA
逻辑门纳米器件共孵育，当细胞膜表面存在靶蛋白时，所述靶蛋白核酸适配体序列与靶蛋白结合，触发逻辑门运算以使所述触发序列暴露；步骤4：在步骤3的反应体系中进一步加入发夹序列孵育，所述发夹序列与所述触发序列结合，使结合在靶蛋白上的
DNA
逻辑门纳米器件顶端形成
G4
纳米线结构，所述发夹序列的核酸序列如
SEQID.NO.2
～4所示；步骤5：在步骤4的反应体系中进一步加入血红素；步骤6：在步骤5的反应体系中一步加入多巴胺和
H2O2，室温孵育
10
‑
120min
，形成黑色聚多巴胺纤维，从而对细胞膜表面靶蛋白显色
。2.
如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞膜表面靶蛋白为蛋白质二聚体
。3.
如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述蛋白质二聚体为
HER2:HER3
异二聚体，其适配体核苷酸序列如
SEQ ID NO.6
...

【专利技术属性】
技术研发人员：王振强，张蓉，李国兵，黄景彬，刘荣兴，周胡悦，王奎，
申请(专利权)人：中国人民解放军陆军军医大学第二附属医院，
类型：发明
国别省市：