一种装载减毒沙门氏菌的中性粒细胞及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种装载减毒沙门氏菌的中性粒细胞及其制备方法和应用，属于生物技术领域

【技术实现步骤摘要】
一种装载减毒沙门氏菌的中性粒细胞及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一种装载减毒沙门氏菌的中性粒细胞及其制备方法和应用
。

技术介绍

[0002]减毒鼠伤寒沙门氏菌
VNP20009(
简称
VNP)
株缺失了
purI
和
msbB
基因以减少毒副作用和感染性休克，是最有潜力的溶瘤菌株之一
。
与野生型鼠伤寒沙门氏菌相比，减毒沙门氏菌
VNP20009
具有显著的抑制肿瘤的能力但具有一定程度的副作用
。
肿瘤中的减毒沙门氏菌
VNP20009
滴度约为其他器官的
1000
倍
(The Journal of Infectious Diseases 2000,181,1996
–
2002.)。
在减毒沙门氏菌
VNP20009
的
I
期临床试验中，除了最高剂量组，大多数黑色素瘤患者没有明显的副作用，证明了其安全性
。
然而，只有在最高剂量组，才观察到减毒沙门氏菌
VNP20009
在肿瘤组织中的定植
(Journal of Clinical Oncology 2002,20,142
‑
152.)。
溶瘤菌的肿瘤定殖率是肿瘤治疗中最重要的因素
。
因此如何平衡溶瘤菌的治疗效果和安全性是亟待解决的问题
。
[0003]为了提高沙门氏菌的治疗效果，报道了许多优秀的研究，如携带针对肿瘤转移关键基因的
shRNA(J Exp Clin Cancer Res 2016,35,107
；
Oncotarget 2016,7,12.)
，表达效应蛋白如干扰素
‑
γ
蛋白或细胞毒蛋白
(Eur J Cancer 2017,70,48
‑
61.)
，以及荷载可编码肿瘤特异性抗原的质粒
(Scientific Reports 2016,6,34178
；
Biotechnol Bioeng 2016,113,2698
‑
2711.)
，或共价结合的光敏剂或细胞毒性生物材料
(Biomaterials 2019,214,119226
；
ACS Nano 2018,12,5995
‑
6005.)。
最近的研究表明，细菌免疫原性屏蔽是增加溶瘤菌在肿瘤中定植的可行措施
。
据报道，细胞膜包裹细菌可降低细菌的免疫原性缓解细菌的血管清除率，从而增强肿瘤的靶向性和安全性
(Nature Communication 2019,10,3452.)。
[0004]有证据表明，
VNP20009
通过血管穿透从而定植于肿瘤核心区域，这表明
VNP20009
在血液中的快速清除可能导致了
VNP20009
的肿瘤定植不良
(J Control Release 2015,199,180
‑9；
Cancer Gene Ther 2011,18,457
‑
66.)。Westphal
的工作证实了这一假设，该工作报告称，宿主中性粒细胞的耗尽会导致肿瘤中细菌滴度增加
(Cancer Res 2008,68,2952
‑
60.)。
还有研究报道通过耗尽宿主中性粒细胞，可以观察到
VNP20009
增强的肿瘤治疗效果
(Theranostics 2017,7,2250
‑
2260.)。
中性粒细胞可通过吞噬来装载药物，被招募至肿瘤区域后通过细胞裂解释放药物
(Adv Mater 2018,30,e1706245
；
Adv Mater 2020,32,e2003598.)。

技术实现思路

[0005]如何利用中性粒细胞装载减毒沙门氏菌，以降低细菌的免疫原性
、
缓解细菌的血管清除率，增强肿瘤的靶向性和安全性；同时，又能避免中性粒细胞固有的清除细菌的特性而导致被装载的减毒沙门氏菌不被清除而仍能保持活性？本专利技术的目的是提供一种装载减毒沙门氏菌的中性粒细胞及其制备方法和应用，有效提升细菌的肿瘤定植速率以及肿瘤靶
向性，其可通过直接杀死肿瘤细胞以及释放胞内溶瘤细菌以诱导抗肿瘤免疫反应，有效抑制黑色素瘤
。
[0006]为了解决现有技术的问题，本专利技术提供了如下技术方案：本专利技术的一种装载减毒沙门氏菌的中性粒细胞，所述装载减毒沙门氏菌的中性粒细胞包括中性粒细胞和溶瘤细菌，所述溶瘤细菌为减毒鼠伤寒沙门氏菌
VNP20009
及其衍生的重组工程菌株，所述重组工程菌株为不携带或携带表达治疗基因
、
示踪基因外源基因的表达质粒的菌株
。
减毒沙门氏菌
VNP20009
，包括前述已经申请专利技术专利的各菌株
(ZL201410209851.7
，
ZL201610946268.3
，
ZL201610945015.4
，
ZL201610945021.X
，
202010182038.0
；
Acta Pharmaceutica Sinica B 2021,11(10):3165
‑
3177
；
phoP/phoQ
，等
)
都已被实验证明都具有相似的肿瘤靶向性和抗肿瘤疗效，上述改造菌株具有比
VNP20009
更低的毒性
。
这些改造菌株都具有与
VNP20009
相似的
、
能够与生物药
、
基因治疗
、
化疗
、
中药联合治疗的疗效
。
[0007]进一步地，可在减毒鼠伤寒沙门氏菌
VNP20009
中表达的治疗性或具有示踪效果的基因包括免疫检查点阻断剂抗体基因
、
细胞因子基因
、
血管生成抑制剂基因
、
细胞凋亡类抗肿瘤基因或干扰质粒中的至少一种；所述可被减毒鼠伤寒沙门氏菌
VNP20009
携带的干扰质粒包括以
pRNA
‑
U6.1
为骨架的
、
可表达干扰
RNA
的干扰质粒
。
[0008]进一步地，可在减毒鼠伤寒沙门氏菌
VNP20009
中表达具有示踪效果的基因包括红色荧光蛋白
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种装载减毒沙门氏菌的中性粒细胞，其特征在于：所述装载减毒沙门氏菌的中性粒细胞包括中性粒细胞和溶瘤细菌，所述溶瘤细菌为减毒鼠伤寒沙门氏菌
VNP20009
及其衍生的重组工程菌株，所述重组工程菌株为不携带或携带表达治疗基因
、
示踪基因外源基因的表达质粒的菌株
。2.
权利要求1所述的中性粒细胞装载的重组减毒沙门氏菌工程菌，其特征在于：可在减毒沙门氏菌
VNP20009
及其衍生的重组工程菌株中表达治疗性或具有示踪效果的基因包括免疫检查点阻断剂抗体基因
、
细胞因子基因
、
血管生成抑制剂基因
、
细胞凋亡类抗肿瘤基因和干扰质粒中的至少一种；所述可被减毒鼠伤寒沙门氏菌
VNP20009
携带的干扰质粒包括以
pRNA
‑
U6.1
为骨架的
、
可表达干扰
RNA
的干扰质粒
。3.
根据权利要求2所述的中性粒细胞装载的重组减毒沙门氏菌工程菌，其特征在于：所述可在减毒鼠伤寒沙门氏菌
VNP20009
中表达具有示踪效果的基因包括红色荧光蛋白
RFP
基因
、
绿色荧光蛋白
GFP
基因和荧光素酶示踪蛋白
LuxCDABE
基因中的至少一种
。4.
根据权利要求3所述的中性粒细胞装载的重组工程减毒沙门氏菌工程菌，其特征在于：所述红色荧光蛋白
RFP
基因的核苷酸序列为
SEQ ID No.1
所示，所述绿色荧光蛋白
GFP
基因的核苷酸序列为
SEQ ID No.2
所示，所述荧光素酶示踪蛋白
LuxCDABE
基因的核苷酸序列为
SEQ ID No.3
所示
。5.
根据权利要求2所述的中性粒细胞装载的重组工程减...

【专利技术属性】
技术研发人员：华子春，刘丽娜，
申请(专利权)人：南京吉芮康生物科技研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：