EV71制造技术

本发明专利技术公开了一种

【技术实现步骤摘要】
EV71蛋白酶抑制剂的筛选方法和抑制效果评价方法


[0001]本专利技术涉及生物医药
，特别涉及一种
EV71
蛋白酶抑制剂的筛选方法和抑制效果评价方法
。

技术介绍

[0002] 手足口病（
Hand, foot, mouth disease, HFMD
）是一种常见的儿童感染性疾病，可由多种肠道病毒引起，多发于学龄前儿童，三岁以下婴幼儿普遍易感
。
其中肠道病毒
71
型（
Enterovirus 71
，
EV71
）是引发手足口病的主要病原体之一
。
在手足口病患者中，有
70%
的重症是由
EV71
感染引起的，其中因
HFMD
致死的患者中，高达
90%
是由
EV71
感染导致的
。
因此，急需开发有效的抗病毒药物
。
[0003] EV71
是一种非包膜病毒，属于小
RNA
病毒科
(Picornavirus)
肠道病毒（
enterovirus
）属
。EV71
的基因组是一个长约
7.4 kb
的单股正链
RNA
，其中间的
ORF
编码约
2194
个氨基酸的多肽
。
在
EV71
复制过程中，该多肽首先被水解成3个前体蛋白
(P1
至
P3)
，接着在病毒编码的
2A
蛋白酶和
3C
蛋白酶作用下进一步切割成四个结构蛋白和七个非结构蛋白
。
在翻译多聚蛋白后，
2A
蛋白酶主要负责
VP1
和
2A
之间的连接序列的切割，而
3C
蛋白酶则负责切割其余多聚蛋白中其他八个连接位点，是主要的蛋白酶
。EV71 3C
蛋白酶参与了
EV71
的多个病理过程，在
EV71
病毒复制
、
诱导宿主细胞凋亡和抑制宿主的抗病毒免疫反应等诸多方面都起着非常重要的作用，因此针对抗
EV71
病毒药物的研发，
3C
蛋白酶可以作为最主要的靶点之一
。
[0004] 目前临床使用的治疗手足口病药物主要为传统的广谱抗病毒药物
。
但针对
EV71
已经研发了多种抗病毒药物，包括干扰病毒进入宿主的
Pleconaril
和
BPR0Z
‑
194
，抑制
3C
蛋白酶活性的
Rupintrivir
，靶向病毒复制的
DTriP
‑
22
以及靶向病毒翻译的
Kaempferol。
其中
3C 蛋白酶在
EV71
复制和宿主细胞凋亡中起重要作用，并且
EV71 3C
蛋白酶与哺乳动物蛋白酶没有同源性，这使得
3C
蛋白酶成为抗病毒药物开发中最突出的靶点
。
[0005] 大多数高传染性病毒的细胞抗病毒实验需要在
BSL
‑
2+
或者更高等级的实验室进行，然而这种实验室的资源相当短缺
。
目前，
EV71 3C
蛋白酶抑制剂的活性评价方法主要为荧光共振能量转移法，是在体外或非细胞水平体外进行酶促和抑制实验
。
荧光共振能量转移法虽然具有高通量
、
快捷
、
灵敏
、
可定量和重复性好等优点，但许多体外活性良好的抑制剂因为其细胞膜通透性或者特异性不好，所以该方法并不能完全反应蛋白酶抑制剂在细胞内的效应
。
因此，开发一种细胞水平的简洁
、
安全
、
高通量和可重复性的蛋白酶活性和蛋白酶抑制剂筛选及活性检测方法十分必要
。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种
EV71
蛋白酶抑制剂的筛选方法和抑制效果评价方法，无需使用活病毒，安全性好，能够高效
、
准确
、
稳定
、
高通量的进行
EV71
蛋白酶抑制剂的筛选和抑制效果评价
。
[0007]本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种
EV71
蛋白酶抑制剂的筛选方法，包括以下步骤：（1）构建共表达改造的
GFP
和
EV71 3C
蛋白酶的质粒，所述改造的
GFP
为在野生型
GFP
上插入
EV71 3C
蛋白酶切割序列而成；（2）筛选：将待转染细胞铺于多孔板中，然后加入共表达改造的
GFP
和
EV71 3C
蛋白酶的质粒进行转染，对转染后的细胞进行培养，同时向多孔板中添加不同组的待筛选抑制剂，以不添加待筛选抑制剂的为对照，观察细胞状态及荧光拍照，并检测荧光强度；若与对照相比荧光强度增加，则表示待筛选抑制剂具有抑制效果，荧光强度增加越多则代表待筛选抑制剂的抑制效果越强
。
[0008] 本专利技术在绿色荧光蛋白（
GFP
）中插入
EV71
的
3C
蛋白酶相关裂解位点的序列，形成改造后的荧光蛋白报告蛋白系统，在该荧光蛋白报告蛋白质粒上，克隆表达
EV71 3C
蛋白酶，可用于筛选蛋白酶抑制剂以及对蛋白酶抑制剂活性的评价，最终形成
EV71
蛋白酶抑制剂筛选及药效评价平台
。
本专利技术能够避免使用
EV71
活病毒引发的安全性顾虑，对生物安全等级要求低，
BSL
‑1级实验室即可满足实验要求，是高效
、
准确
、
稳定
、
高通量
、
可重复的用于
EV71
蛋白酶抑制剂筛选及药效评价平台
。
[0009] EV71 3C
蛋白酶切割序列在野生型
GFP
氨基酸序列上的插入位点包括位点
A、
位点
B
和位点
C
；位点
A
为野生型
GFP
氨基酸序列第
158~159
位氨基酸，或与野生型
GFP
氨基酸序列相比具有
99%
以上序列一致性的氨基酸序列上对应的氨基酸区域；位点
B
为野生型
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种
EV71
蛋白酶抑制剂的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）构建共表达改造的
GFP
和
EV71 3C
蛋白酶的质粒，所述改造的
GFP
为在野生型
GFP
上插入
EV71 3C
蛋白酶切割序列而成；（2）筛选：将待转染细胞铺于多孔板中，然后加入共表达改造的
GFP
和
EV71 3C
蛋白酶的质粒进行转染，对转染后的细胞进行培养，同时向多孔板中添加不同组的待筛选抑制剂，以不添加待筛选抑制剂的为对照，观察细胞状态及荧光拍照，并检测荧光强度；若与对照相比荧光强度增加，则表示待筛选抑制剂具有抑制效果，荧光强度增加越多则代表待筛选抑制剂的抑制效果越强
。2. 根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，
EV71 3C
蛋白酶切割序列在野生型
GFP
氨基酸序列上的插入位点包括位点
A、
位点
B
和位点
C
；位点
A
为野生型
GFP
氨基酸序列第
158~159
位氨基酸，或与野生型
GFP
氨基酸序列相比具有
99%
以上序列一致性的氨基酸序列上对应的氨基酸区域；位点
B
为野生型
GFP
氨基酸序列第
117~118
位氨基酸，或与野生型
GFP
氨基酸序列相比具有
99%
以上序列一致性的氨基酸序列上对应的氨基酸区域；位点
C
为野生型
GFP
氨基酸序列第
159~160
位氨基酸，或与野生型
GFP
氨基酸序列相比具有
99%
以上序列一致性的氨基酸序列上对应的氨基酸区域；所述野生型
GFP
氨基酸序列见
SEQ ID No.1
所示
。3. 根据权利要求1或2所述的筛选方法，其特征在于，
EV71 3C
蛋白酶切割序列包括
cut1、cut2
，
cut1
氨基酸序列见
SEQ ID No.2
所示，
cut2
氨基酸序列见
SEQ ID No.3
所示
。4. 一种共表达改造的
GFP
和
EV71 3C
蛋白酶的质粒，其特征在于，所述质粒包括表达
EV71 3C
蛋白酶的编码基因序列以及...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙慧敏，余飞，欧阳歆，方晨捷，宋家升，
申请(专利权)人：浙江迪福润丝生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：