穿透支原体制造技术

本发明专利技术属于病原生物学和医学技术领域，特别涉及穿透支原体

【技术实现步骤摘要】
穿透支原体P35脂蛋白在SV
‑
HUC
‑
1细胞膜上的受体蛋白的用途及确定方法


[0001]本专利技术属于病原生物学和医学
，特别涉及穿透支原体
P35
脂蛋白在
SV
‑
HUC
‑1细胞膜上的受体蛋白的用途及确定方法
。

技术介绍

[0002]穿透支原体
(Mycoplasmapenetrans,Mpe)
是一种首次从人类免疫缺陷病毒
(HIV)
感染者的尿液中分离到的支原体
。
这种支原体具有独特的细长的烧瓶状形态和尖形结构，体内外试验都证实其具有入侵细胞的能力
。Mpe
与宿主靶细胞之间的连接是在脂质相关膜蛋白
(LAMP)
上的，特别是暴露在细胞表面的
P35
脂蛋白
。P35
脂蛋白是一种免疫优势抗原，是
Mpe
感染血清学诊断的主要候选抗原
。
因此，
P35
脂蛋白在
Mpe
感染和黏附宿主过程中发挥着重要作用
。
然而，对
P35
脂蛋白的受体蛋白和其结合功能域的研究目前还甚少
。
本专利技术旨在筛选出
Mpe
‑
P35
在人尿道上皮细胞
(SV
‑
HUC
‑1细胞
)
膜上的受体蛋白，为有效预防和治疗
Mpe
感染奠定实验基础
。

技术实现思路

[0003]本专利技术表达纯化了含
P35
全部氨基酸的重组蛋白
P35(rP35)
，并通过改进的病毒铺覆蛋白结合实验
(VOPBA)
从人尿道上皮细胞
(SV
‑
HUC
‑
1)
的膜蛋白中筛选与
rP35
相互作用的受体蛋白
。
通过对筛选的蛋白进行高效液相色谱
‑
质谱
(HPLC
‑
MS)
，发现膜蛋白中的
γ
‑
肌动蛋白
(ACTG1)
和角蛋白
8(KRT8)
可能是主要的受体蛋白
。
随后通过4个独立的实验技术证实了
rP35
能与宿主细胞膜上的
ACTG1
蛋白发生特异性结合，而不与
KRT8
发生相互作用
。
再通过采用黏附
‑
黏附抑制实验证明
ACTG1
蛋白是
Mpe
‑
P35
蛋白黏附
SV
‑
HUC
‑1细胞的主要受体
。
由此阐明了
Mpe
经
P35
黏附和入侵宿主细胞的机制，为有效预防和治疗
Mpe
感染奠定实验基础，为利用
SV
‑
HUC
‑1细胞膜上的受体蛋白
ACTG1
或其抗体制备治疗或预防与穿透支原体
P35
脂蛋白相互作用的药物提供了理论基础
。
[0004]本专利技术的具体技术方案为：利用
SV
‑
HUC
‑1细胞膜上的受体蛋白
ACTG1
制备治疗或预防与穿透支原体
P35
脂蛋白相互作用的药物中的用途
。
[0005]利用
SV
‑
HUC
‑1细胞膜上的受体蛋白
ACTG1
的抗体制备治疗或预防与穿透支原体
P35
脂蛋白相互作用的药物中的用途
。
[0006]一种确定与穿透支原体
P35
脂蛋白相互作用的
SV
‑
HUC
‑1细胞膜上的受体蛋白
ACTG1
的方法，包括以下步骤：
[0007]步骤
1.
穿透支原体
P35
脂蛋白的表达纯化：诱导表达
、
纯化含
P35
全部氨基酸的重组蛋白
P35
，将所得重组蛋白
P35
浓缩并进行浓度鉴定；
[0008]步骤
2.
重组蛋白
P35
抗体的制备：将重组蛋白
P35
与弗氏佐剂混合，对兔进行免疫
、
免疫后收集兔血清，将免疫球蛋白部分经连续硫酸铵沉淀法粗提纯，然后经溴化氰活化的琼脂糖
4B
偶联和洗脱对重组蛋白
P35
特异的抗体进行纯化；
[0009]步骤
3.
判断
P35
是否为穿透支原体对
SV
‑
HUC
‑1细胞的黏附相关蛋白：分别培养
SV
‑
HUC
‑1细胞和穿透支原体；通过间接免疫荧光试验检测重组蛋白
P35
和穿透支原体黏附
SV
‑
HUC
‑1细胞的情况，以及检测步骤2所制备的重组蛋白
P35
抗体能否抑制穿透支原体对
SV
‑
HUC
‑1细胞的黏附；
[0010]步骤
4.
分析
SV
‑
HUC
‑1细胞膜中可能与重组蛋白
P35
发生特异结合的受体蛋白：取
SV
‑
HUC
‑1细胞膜蛋白进行
SDS
‑
PAGE
分析，然后切取与改良
VOPBA
实验中明显条带对应的
40kDa
～
55kDa
附近胶条进行
HPLC
‑
MS
分析出
SV
‑
HUC
‑1细胞膜中可能与重组蛋白
P35
发生特异结合的受体蛋白为
ACTG1
和
KRT8
；
[0011]步骤
5.
鉴定受体蛋白
ACTG1
和
KRT8
是否存在于
SV
‑
HUC
‑1细胞膜上并确定受体蛋白
ACTG1
和
KRT8
的分布情况：利用
Western blotting
对受体蛋白进行鉴定，并通过间接免疫荧光观察其在
SV
‑
HUC
‑1细胞膜中的分布情况
、
确定受体蛋白
ACTG1
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
利用
SV
‑
HUC
‑1细胞膜上的受体蛋白
ACTG1
制备治疗或预防与穿透支原体
P35
脂蛋白相互作用的药物中的用途
。2.
利用权利要求1所述
SV
‑
HUC
‑1细胞膜上的受体蛋白
ACTG1
的抗体制备治疗或预防与穿透支原体
P35
脂蛋白相互作用的药物中的用途
。3.
一种确定权利要求1中与穿透支原体
P35
脂蛋白相互作用的
SV
‑
HUC
‑1细胞膜上的受体蛋白
ACTG1
的方法，其特征在于包括以下步骤：步骤
1.
穿透支原体
P35
脂蛋白的表达纯化：诱导表达
、
纯化含
P35
全部氨基酸的重组蛋白
P35
，将所得重组蛋白
P35
浓缩并进行浓度鉴定；步骤
2.
重组蛋白
P35
抗体的制备：将重组蛋白
P35
与弗氏佐剂混合，对兔进行免疫
、
免疫后收集兔血清，将免疫球蛋白部分经连续硫酸铵沉淀法粗提纯，然后经溴化氰活化的琼脂糖
4B
偶联和洗脱对重组蛋白
P35
特异的抗体进行纯化；步骤
3.
判断
P35
是否为穿透支原体对
SV
‑
HUC
‑1细胞的黏附相关蛋白：分别培养
SV
‑
HUC
‑1细胞和穿透支原体；通过间接免疫荧光试验检测重组蛋白
P35
和穿透支原体黏附
SV
‑
HUC
‑1细胞的情况，以及检测步骤2所制备的重组蛋白
P35
抗体能否抑制穿透支原体对
SV
‑
HUC
‑1细胞的黏附；步骤
4.
分析
SV
‑
HUC
‑1细胞膜中可能与重组蛋白
P35
发生特异结合的受体蛋白：取
SV
‑
HUC
‑1细胞膜蛋白进行
SDS
‑
PAGE
分析，然后切取与改良
VOPBA
实验中明显条带对应的
40kDa
～
55kDa
附近胶条进行
HPLC
‑
MS
分析出
SV
‑
HUC
‑1细胞膜中可能与重组蛋白
P35
发生特异结合的受体蛋白为
ACTG1
和
KRT8
；步骤
5.
鉴定受体蛋白
ACTG1
和
KRT8
是否存在于
SV
‑
HUC
‑1细胞膜上并确定受体蛋白
ACTG1
和
KRT8
的分布情况：利用
Westernblotting
对受体蛋白进行鉴定，并通过间接免疫荧光观察其在
SV
‑
HUC
‑1细胞膜中的分布情况
、
确定受体蛋白
ACTG1
和
KRT8
在
SV
‑
HUC
‑1细胞上的定位；步骤
6.
验证两种受体蛋白
ACTG1
和
KRT8
是否能与重组蛋白
P35
发生相互作用：通过
Far
‑
western blotting、
间接
ELISA、
免疫共沉淀和免疫荧光共定位4种独立的实验方法确定重组蛋白
P35
能与
ACTG1
发生特异结合
、
但不与
KRT8
发生相互作用；步骤
7.
验证
ACTG1
是否影响穿透支原体和重组蛋白
P35
对
SV
‑
HUC
‑1细胞的黏附：采用黏附
‑
黏附抑制实验并利用间接免疫荧光观察
ACTG1
及其抗体对穿透支原体和重组蛋白
P35
黏附
SV
‑
HUC
‑1细胞的影响，最终确定
ACTG1
蛋白是
Mpe
‑
P35
蛋白黏附
SV
‑
HUC
‑1细胞的主要受体
。4.
根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤3中检测重组蛋白
P35
和穿透支原体黏附
SV
‑
HUC
‑1细胞的情况，以及检测重组蛋白
P35
抗体能否抑制穿透支原体对
SV
‑
HUC
‑1细胞的黏附的具体操作为：
(1)
铺板：取一瓶生长状态良好的
SV
‑
HUC
‑1细胞，加入完全培养基，吹打均匀；向带有无菌爬片的
24
孔板孔内加入细胞悬液和完全培养液，混匀后置于
37℃
，5％
CO2培养箱中培养；
(2)
将细胞分组进行实验：
①
rP35
黏附组：更换新鲜培养基后，向孔内加入
50
μ
g/mL
的
rP35
，所述
rP35
即重组蛋白
P35
，
37℃
孵育过夜；
②
Mpe
黏附组：更换新鲜培养基后，向孔内加入1×
107CCU/mL
的
Mpe
，所述
Mpe
即穿透支原
体，
37℃
孵育过夜；
③
抗体黏附抑制组：在与
SV
‑
HUC
‑1细胞孵育前，先将
Mpe
与
rP35
特异性兔抗或免疫前血清在
37℃
条件下预孵育
2h
，更换新鲜培养基后与细胞孵育；
④
空白对照组：只更换新鲜培养基，其余不做任何处理；
(3)
固定：
PBS
冲洗细胞3次，洗涤后每孔加入4％的多聚甲醛，
4℃
固定细胞
30min
；
(4)
封闭：
PBS
洗涤4次，洗涤后每孔加入
F
‑
12K
完全培养基，
37℃
封闭
1h
；
(5)
一抗：
PBS
洗涤3次，根据细胞分组加入不同的一抗；
①
rP35
黏附组：加入
150
μ
L
的
rP35
兔抗，
37℃
孵育
2h
；
②
Mpe
黏附组：加入
150
μ
L
的
Mpe
兔抗，
37℃
孵育
2h
；
③
抗体黏附抑制组：加入
150
μ
L
的
Mpe
兔抗，
37℃
孵育
2h
；
④
空白对照组：加入
150
μ
L
的
rP35
兔抗或
Mpe
兔抗，
37℃
孵育
2h
；
(5)
二抗：
PBS
洗涤5次，洗涤后加入
Alexa Fluor 488
偶联的羊抗兔
IgG
，避光
37℃
染色
1h
；
(6)
核染：
PBS
洗涤5次，洗涤后加入
DAPI
，避光
37℃
孵育
10min
；
...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗浩荡，曾焱华，黎霞，肖花，何军，
申请(专利权)人：南华大学附属南华医院，
类型：发明
国别省市：