一种定量检测S-棕榈酰化修饰目标蛋白的ELISA试剂盒及其使用方法技术

本发明专利技术涉及蛋白检测技术领域，具体涉及一种定量检测S

【技术实现步骤摘要】
一种定量检测S
‑
棕榈酰化修饰目标蛋白的ELISA试剂盒及其使用方法


[0001]本专利技术属于蛋白检测
，特别涉及一种定量检测S
‑
棕榈酰化修饰目标蛋白的ELISA检测试剂盒及其使用方法。

技术介绍

[0002]S
‑
棕榈酰化修饰(S
‑
palmitoylation)是指长链脂肪酸(通常指16碳棕榈酸)通过硫酯键共价结合到蛋白质半胱氨酸(Cys)残基上，是一种广泛存在于生物体内动态、可逆的蛋白翻译后修饰形式，在调控蛋白质的转运、定位和稳定性等方面具有重要的作用，与肿瘤、免疫、炎症、代谢等多种疾病的发生、发展密切相关。
[0003]目前分析检测S
‑
棕榈酰化修饰蛋白的实验方法主要分两类：(1)酰基
‑
生物素替换(Acyl
‑
biotinyl exchange,ABE)方法；(2)点击化学(Click chemistry)方法。第一类酰基
‑
生物素替换方法，是抽提细胞或者组织蛋白样品后先用N
‑
乙基顺丁烯二酰亚胺(N
‑
Ethylmaleimide,NEM)等封闭蛋白质半胱氨酸(Cys)残基上所有的游离巯基，后用羟胺(NH2OH)选择性切开蛋白质半胱氨酸(Cys)残基上以硫酯键结合的脂肪酸(棕榈酸最为典型)修饰基团，切开后新产生的自由巯基与具有巯基特异反应活性的试剂(如，HPDP
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biotin)反应形成二硫键，使新产生的自由巯基标记上生物素，后利用生物素与亲和素相互作用进行富集和洗脱，再进行SDS
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PAGE电泳和开展高通量蛋白质谱分析，鉴定S
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棕榈酰化修饰蛋白(该方法主要用于鉴定S
‑
棕榈酰化修饰蛋白)。第二类点击化学方法，使用含炔基的棕榈酸盐类似代谢物(Palmitic Acid Alkyne,Alk
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14)标记培养的细胞(或者标记动物组织)，然后裂解细胞或组织获取蛋白样品，利用叠氮化物(azide)和炔烃(alkyne)反应形成的共价键具有高效稳定、高特异性等优点，选择性地将带叠氮或者炔基基团的蛋白质连接到生物素或者荧光基团上，进而也是利用生物素与亲和素相互作用富集和洗脱，再进行SDS
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PAGE电泳后检测荧光信号或开展高通量蛋白质谱分析，鉴定S
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棕榈酰化修饰蛋白(该方法也主要用于鉴定S
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棕榈酰化修饰蛋白)。上述两类实验方法主要侧重于鉴定分析S
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棕榈酰化修饰目标蛋白及确认具体的修饰位点，正如中国专利文献CN106153941B、CN113358634A所报道的，通过复杂繁琐的样品富集处理，联合WB或质谱法进行定性鉴定，为新的S
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棕榈酰化修饰蛋白的发现和鉴定带来了很大的突破。新近报道发现PD
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L1，NOD1，STAT3等多个蛋白存在S
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棕榈酰化修饰，在肿瘤，免疫和炎症等疾病中发挥重要的调控作用，为后续开展这些S
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棕榈酰化修饰蛋白在其他疾病中的生物学作用提供理论支持。事实上，在基础和应用研究中，前期通过上述两类方法(酰基
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生物素替换方法和点击化学方法)鉴定出S
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棕榈酰化修饰的目标蛋白后，后续还需进一步围绕S
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棕榈酰化修饰目标蛋白开展相关的机制与功能研究，此研究过程涉及多次、反复，或高通量定量分析S
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棕榈酰化修饰目标蛋白，如高通量筛选靶向S
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棕榈酰化修饰目标蛋白的小分子抑制剂等研究。鉴于上面描述的两类鉴定S
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棕榈酰化修饰蛋白的实验方法主要侧重点在于发现和鉴定新的S
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棕榈酰化修饰蛋白，实验过程复杂、繁琐，一定程度上影响了S
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棕榈酰化修饰目标蛋白定量分析的
准确性，且受限于实验过程复杂不适合开展高通量检测。目前尚没有报道能很好的可开展高通量定量检测S
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棕榈酰化修饰目标蛋白的实验方法。为了满足对S
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棕榈酰化修饰目标蛋白的高通量定量检测，亟需研究开发一种能高通量地定量检测S
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棕榈酰化修饰目标蛋白的检测试剂盒及其使用方法。

技术实现思路

[0004]鉴于现有技术的检测方法均侧重于鉴定S
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棕榈酰化修饰蛋白(酰基
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生物素替换方法和点击化学方法)，目前尚没有报道能很好的可开展高通量定量检测S
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棕榈酰化修饰目标蛋白的实验方法。
[0005]本专利技术通过大量地实验与综合分析，开发出一种综合应用免疫沉淀(Immunoprecipitation,IP)，点击化学(Click chemistry)和酶联免疫吸附(ELISA)等实验原理，实现了高通量定量检测S
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棕榈酰化修饰目标蛋白的效果，该方法适用于S
‑
棕榈酰化修饰目标蛋白的作用机制与功能研究(如高通量筛选靶向S
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棕榈酰化修饰目标蛋白的小分子抑制剂等)，提高了实验效率。
[0006]本专利技术开发的一种定量检测S
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棕榈酰化修饰目标蛋白的ELISA检测试剂盒，包括磁力装置、多孔板、溶液A、溶液B、溶液C、溶液D、溶液E、溶液F、溶液G。
[0007]其中
[0008]溶液A为Palmitic Acid Alkyne(Alk
‑
14)的DMSO溶液；
[0009]溶液B为NP40裂解液；
[0010]溶液C为NP40缓冲液；
[0011]溶液D为反应混合液；
[0012]溶液E为信号底物溶液；
[0013]溶液F为信号底物响应剂；
[0014]溶液G为TBST缓冲液。
[0015]进一步地，
[0016]溶液A为10mM Palmitic Acid Alkyne(Alk
‑
14)的DMSO溶液；
[0017]溶液B为1％ NP40裂解液，含50mM Tris
‑
HCl,pH 7.4,150mM NaCl,1％ NP40(v:v)，蛋白酶抑制剂；
[0018]溶液C为0.1％ NP40缓冲液；
[0019]溶液D为反应混合液，含10mM生物素
‑
叠氮，50mM三(2
‑
羰基乙基)磷盐酸盐,10mM三(1
‑
苄基
‑
1H
‑
1,2,3
‑
三唑
‑4‑
基)甲基胺,50mM硫酸铜；(溶液D反应混合液中各成分试剂浓度为多次实验最终确定)
[0020]溶液E为1.25mg/mL链霉素
‑
HRP水溶液或HRP荧光底物或本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种定量检测S
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棕榈酰化修饰目标蛋白的ELISA检测试剂盒，其特征在于：包括磁力装置、多孔板、溶液A、溶液B、溶液C、溶液D、溶液E、溶液F、溶液G；溶液A为Palmitic Acid Alkyne(Alk
‑
14)的DMSO溶液；溶液B为NP40裂解液；溶液C为NP40缓冲液；溶液D为反应混合液；溶液E为信号底物溶液；溶液F为信号底物响应剂；溶液G为TBST缓冲液。2.根据权利要求1所述的一种定量检测S
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棕榈酰化修饰目标蛋白的ELISA检测试剂盒，其特征在于：溶液A为10mM Palmitic Acid Alkyne(Alk
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14)的DMSO溶液；溶液B为1％NP40裂解液，含50mM Tris
‑
HCl,pH 7.4,150mM NaCl,1％NP40(v:v)，蛋白酶抑制剂；溶液C为0.1％NP40缓冲液；溶液D为反应混合液，含10mM生物素
‑
叠氮，50mM三(2
‑
羰基乙基)磷盐酸盐，10mM三(1
‑
苄基
‑
1H
‑
1,2,3
‑
三唑
‑4‑
基)甲基胺，50mM硫酸铜；溶液E为1.25mg/mL链霉素
‑
HRP水溶液或HRP荧光底物或HRP化学发光底物；溶液F为TMB显色液或HRP荧光反应剂或HRP化学发光试剂；溶液G为TBST缓冲液(10
×
，pH7.4)。3.根据权利要求1所述的一种定量检测S
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棕榈酰化修饰目标蛋白的ELISA检测试剂盒，其特征在于：溶液A1mL、溶液B10mL、溶液C10mL，
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20℃保存；溶液D 3mL,4℃保存；溶液E 10μL，4℃保存；溶液F 10mL，溶液G 100mL，4℃避光保存。4.根据权利要求1所述的一种定量检测S
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棕榈酰化修饰目标蛋白的ELISA检测试剂盒，其特征在于：所述磁力装置由Protein G磁珠和多孔板磁力架构成。5.根据权利要求4所述的一种定量检测S
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棕榈酰化修饰目标蛋白的ELISA检测试剂盒，其特征在于：所述多孔板为96孔板。6.一种定量检测S
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棕榈酰化修饰目标蛋白的ELISA检测试剂盒的实验原理，其特征在于：包括IP和Click chemistry和ELISA实验方法的结合。7.根据权利要求6所述的一种定量检测S
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棕榈酰化修饰目标蛋白的ELISA检测试剂盒的实验原理，其特征在于：包括Metabolic labeling和IP和Click chemistry和ELISA实验方法的结合。8.基于权利要求7所述原理的一种定量检测S
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【专利技术属性】
技术研发人员：肖兵，邓爱华，王云，王韵，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院附属新华医院，
类型：发明
国别省市：