化学组合物及其使用方法技术

本公开提供用于使用荧光探针检测和鉴定组织样品内靶核酸的组合物和方法，其中所述探针包含靶结合结构域和条形码结构域

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】化学组合物及其使用方法
[0001]相关申请的交叉参考
[0002]本申请要求
2020
年9月
16
日递交的美国临时申请号
63/078,965
的优先权和权益
。
上述专利申请的内容通过参考以其全部结合至本文中，用于所有目的
。

技术介绍

[0003]尽管目前有多种方法用于检测生物样品中的核酸和蛋白，但仍然需要经改进
、
准
、
快速和灵敏的确生物样品内靶核酸和蛋白的多重检测
、
鉴定和量化
。
具体地讲，需要检测维持其初始形态的组织样品中特定核酸和蛋白的丰度和空间位置的能力
。
本公开解决该需求
。

技术实现思路

[0004]本公开提供确定生物样品中至少两种靶分析物的丰度和空间位置的方法，其中生物样品通过以下制备：
i)
通过将安装的生物样品与包含多种
ISH
探针的溶液一起温育而使生物样品与至少一种核酸探针接触，其中溶液包含至少两种
ISH
探针，其中至少一种
ISH
探针包含与至少两种靶分析物之一结合的独特靶结合结构域和对靶分析物具有特异性的独特条形码结构域，其中条形码结构域包含至少一个附接位置；
ii)
洗涤生物样品，该方法包括：
a)
使制备的生物样品与多种报告探针接触，其中每种报告探针包含至少一个可检测标记，从而使报告探针与同生物样品中的靶分析物杂交的至少一种
ISH
探针的条形码结构域的附接区域杂交；
b)
从生物样品中去除非杂交的报告探针；
c)
记录杂交的报告探针的可检测标记的身份和空间位置；
d)
去除杂交的报告探针的可检测标记；和
e)
重复步骤
(a)
‑
(d)
直至与生物样品中的靶分析物杂交的
ISH
探针的条形码结构域中的每个附接位置已经与包含至少一个可检测标记的报告探针杂交，从而基于其中记录了可检测标记的序列来确定生物样品中至少两种靶分析物的丰度和空间位置
。
[0005]在本公开方法的一些方面，至少两种靶分析物为靶核酸分子，并且其中靶结合结构域为包含与靶核酸互补的核酸序列的单链多核苷酸，其中靶结合结构域的长度为约
35
‑
约
40
个核苷酸，并且其中靶结合结构域包含
D
‑
DNA
，并且其中条形码结构域为包含至少一个附接区域的单链多核苷酸，其中每个附接区域包含约一个附接序列，其中附接序列中的每一个长度为约
14
个核苷酸，并且其中附接序列中每一个的序列为不同的，并且其中条形码结构域包含
L
‑
DNA。
[0006]在本公开方法的一些方面，至少两种靶分析物为靶蛋白分子，并且其中靶结合结构域包含蛋白，优选地其中蛋白为与靶蛋白分子特异性地结合的抗体或抗原结合片段
。
[0007]在本公开方法的一些方面，条形码结构域包含：
i)
至少两个；
ii)
至少三个；
iii)
至少四个；或
iv)
至少五个附接区域
。
[0008]在本公开方法的一些方面，溶液包含被设计为不与生物样品中的任何靶分析物特异性地结合的至少一种阴性
ISH
探针，优选地其中
ISH
探针包含至少一种外部
RNA
控制联盟
(External RNA Controls Consortium)(ERCC)
评估序列或其补体
。
在本公开方法的一些方
面，阴性
ISH
探针被用于确定生物样品中的背景噪声水平
。
[0009]在本公开方法的一些方面，报告探针包含
L
‑
DNA。
[0010]在本公开方法的一些方面，报告探针包含：含有第一结构域
、
第二结构域以及位于第一结构域和第二结构域之间的光可切割接头的一级核酸分子，其中一级核酸分子的第二结构域与约6个二级核酸分子杂交，其中每个二级核酸分子包含第一结构域
、
第二结构域以及位于第一结构域和第二结构域之间的光可切割接头，其中二级核酸分子中每一个的第一结构域与一级核酸分子的第二结构域杂交，其中二级核酸分子中每一个的第二结构域与约5个三级核酸分子杂交，其中三级核酸分子中的每一个包含至少一个可检测标记，并且其中一级核酸分子
、
二级核酸分子和三级核酸分子包含
L
‑
DNA。
[0011]在本公开方法的一些方面，至少一个可检测标记为荧光部分
。
[0012]在本公开方法的一些方面，该方法进一步包括在步骤
(a)
之前：通过以下预处理生物样品：
i)
将生物样品在磺基
‑
NHS
乙酸酯封闭溶液中温育约
15
分钟；
ii)
用报告基因洗涤缓冲液
(Reporter Wash Buffer)
洗涤生物样品；
iii)
将生物样品在自体荧光抑制缓冲液中温育和
/
或用蓝光和
/
或
UV
光照射生物样品，从而经由光漂白淬灭样品的自体荧光；和
iv)
用报告基因洗涤缓冲液洗涤生物样品
。
[0013]在本公开方法的一些方面，步骤
(a)
包括将生物样品与包含浓度为
5nM
的报告探针
、8.75x SSPE
溶液
、0.5
％吐温
‑
20
和任选地
0.1
％
RNA
酶抑制剂在
DEPC
处理的水中的溶液一起温育至少约
15
分钟
。
[0014]在本公开方法的一些方面，步骤
(b)
包括用报告基因洗涤缓冲液洗涤生物样品
。
[0015]在本公开方法的一些方面，步骤
(c)
包括：
i)
将生物样品浸入成像缓冲液中；和
ii)
对生物样品成像以记录杂交的报告探针的可检测标记的身份和空间位置
。
[0016]在本公开方法的一些方面，步骤
(d)
包括：
i)
进行以下中的至少一项或两项：用足以切割杂交的报告探针中的光可切割接头部分的
UV
光照射生物样品；和用剥离洗涤缓冲液洗涤生物样品；任选地，步骤
(d)
进一步包括：
ii本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.
确定生物样品中至少两种靶分析物的丰度和空间位置的方法，其中所述生物样品通过以下制备：
i)
通过将安装的生物样品与包含多种
ISH
探针的溶液一起温育而使所述生物样品与至少一种核酸探针接触，其中所述溶液包含至少两种
ISH
探针，其中至少一种
ISH
探针中包含与至少两种靶分析物之一结合的独特靶结合结构域和对所述靶分析物具有特异性的独特条形码结构域，其中所述条形码结构域包含至少一个附接位置；
ii)
洗涤所述生物样品，所述方法包括：
a)
使所述制备的生物样品与多种报告探针接触，其中每种报告探针包含至少一个可检测标记，从而使报告探针与同所述生物样品中的靶分析物杂交的至少一种
ISH
探针的条形码结构域的附接区域杂交；
b)
从所述生物样品中去除非杂交的报告探针；
c)
记录所述杂交的报告探针的可检测标记的身份和空间位置；
d)
去除所述杂交的报告探针的可检测标记；和
e)
重复步骤
(a)
‑
(d)
直至与所述生物样品中的靶分析物杂交的
ISH
探针的条形码结构域中的每个附接位置已经与包含至少一个可检测标记的报告探针杂交，从而基于所述其中记录了可检测标记的序列来确定所述生物样品中至少两种靶分析物的丰度和空间位置
。2.
权利要求1的方法，其中所述至少两种靶分析物为靶核酸分子，并且其中所述靶结合结构域为包含与靶核酸互补的核酸序列的单链多核苷酸，其中所述靶结合结构域的长度为约
35
‑
约
40
个核苷酸，并且其中所述靶结合结构域包含
D
‑
DNA
，并且其中所述条形码结构域为包含至少一个附接区域的单链多核苷酸，其中每个附接区域包含约一个附接序列，其中所述附接序列中的每一个长度为约
14
个核苷酸，并且其中所述附接序列中每一个的序列为不同的，并且其中所述条形码结构域包含
L
‑
DNA。3.
权利要求1的方法，其中所述至少两种靶分析物为靶蛋白分子，并且其中所述靶结合结构域包含蛋白，优选地其中所述蛋白为与靶蛋白分子特异性地结合的抗体或抗原结合片段
。4.
前述权利要求中任何一项的方法，其中所述条形码结构域包含：
i)
至少两个；
ii)
至少三个；
iii)
至少四个；或
iv)
至少五个附接区域
。5.
权利要求1的方法，其中所述溶液包含被设计为不与所述生物样品中的任何靶分析
物特异性地结合的至少一种阴性
ISH
探针，优选地其中所述
ISH
探针包含至少一种外部
RNA
控制联盟
(External RNA Controls Consortium)(ERCC)
评估序列或其补体
。6.
权利要求5的方法，其中所述阴性
ISH
探针被用于确定所述生物样品中的背景噪声水平
。7.
前述权利要求中任何一项的方法，其中所述报告探针包含
L
‑
DNA。8.
前述权利要求中任何一项的方法，其中所述报告探针包含：包含第一结构域
、
第二结构域以及位于所述第一结构域和所述第二结构域之间的光可切割接头的一级核酸分子，其中所述一级核酸分子的第二结构域与约6个二级核酸分子杂交，其中每个二级核酸分子包含第一结构域
、
第二结构域以及位于所述第一结构域和所述第二结构域之间的光可切割接头，其中所述二级核酸分子中每一个的第一结构域与所述一级核酸分子的第二结构域杂交，其中所述二级核酸分子中每一个的第二结构域与约5个三级核酸分子杂交，其中所述三级核酸分子中的每一个包含至少一个可检测标记，并且其中所述一级核酸分子
、
所述二级核酸分子和所述三级核酸分子包含
L
‑
DNA。9.
前述权利要求中任何一项的方法，其中所述至少一个可检测标记为荧光部分
。10.
前述权利要求中任何一项的方法，所述方法进一步包括在步骤
(a)
之前：通过以下预处理所述生物样品：
i)
将所述生物样品在磺基
‑
NHS
乙酸酯封闭溶液中温育约
15
分钟；
ii)
用报告基因洗涤缓冲液洗涤所述生物样品；
iii)
将所述生物样品在自体荧光抑制缓冲液中温育和
/
或用蓝光和
/
或
UV
光照射所述生物样品，从而经由光漂白淬灭样品的自体荧光；和
iv)
用报告基因洗涤缓冲液洗涤所述生物样品
。11.
前述权利要求中任何一项的方法，其中步骤
(a)
包括将所述生物样品与包含浓度为
5nM
的报告探针
、8.75x SSPE
溶液
、0.5
％吐温
‑
20
和任选地
0.1
％
RNA
酶抑制剂在
DEPC
处理的水中的溶液一起温育至少约
15
分钟
。12.
前述权利要求中任何一项的方法，其中步骤
(b)
包括用报告基因洗涤缓...

【专利技术属性】
技术研发人员：何珊珊，D，
申请(专利权)人：纳米线科技公司，
类型：发明
国别省市：