呋喃唑酮代谢物检测试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术公开一种呋喃唑酮代谢物化学发光检测试剂盒，包括检测板、试剂，所述试剂包括抗体、检测目标物标准溶液，所述检测目标物为呋喃唑酮代谢物３－氨基－２－恶唑烷酮的对硝基苯化衍生物４－ＮＰＡＯＺ。本发明专利技术呋喃唑酮代谢物检测试剂盒，不仅可以实现快速、大批量检测，而且具有很高的特异性和敏感性，检测灵敏度达０．００５ｐｐｂ。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物工程
，尤其涉及一种呋喃唑酮代谢物检测试剂盒及其检测方法。
技术介绍
AOZ (化学名3-氨基-2-恶唑烷酮)是呋喃唑酮(FuranzoIidone，FZ)在生物体 内主要代谢残留物，经胃酸生成的分解物羟乙基胼为剧毒类物质，对人类有致癌危险。呋喃唑酮又称痢特灵，为硝基呋喃类药物(呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃妥因、呋喃 西林)中最具代表性的一种，是一种人工合成的抗菌药，呈黄色粉末或结晶性粉末，分子量 225. 16，熔点245 258°C，遇碱分解，在强光下颜色逐渐变深。最早发现5-硝基呋喃的抗 菌活性为1944年在美国和德国进行的生物合成和微生物学试验中，随后呋喃唑酮等同系 物相继上市。并发现此类药药效稳定，抑制或杀灭多种革兰氏阳性和阴性细菌，对某些原 虫、真菌有一定作用。因其效高价廉，广泛应用于医药、畜牧及水产养殖中。近年来研究表明呋喃唑酮及其代谢物具有相当大的毒性和副作用，能诱导有机体 基因突变、畸胎、癌症，因而引起了人们的高度重视。目前国内外都对呋喃类物质的控制相 当严格，各国对于测定的标准都有明确的规定。1995年，欧盟国家禁止呋喃唑酮用于食品动 物，随后美国、日本、澳大利亚等国均取消呋喃唑酮在畜、禽、水产生产上的使用。根据给动物喂饲带有示踪标记的呋喃唑酮代谢动力学实验表明，呋喃唑酮在体 内代谢速度很快，而在组织中结合的代谢产物(AOZ)则能存留大约6周时间，结合残留物 总量与AOZ呈显著相关关系，为最合适的呋喃唑酮残留监测的靶化合物。目前AOZ测定 方法主要有液相色谱/紫外(LC/UV)分析和液相色谱/质谱联用分析法(LC/MS)、液相 色谱串联质谱法(LC/MS/MS)，但这些方法所需仪器价格昂贵，实验过程繁琐，不适用于现 场快速检测。目前，在药物残留快速检测中得到广泛应用的有微生物法和酶联免疫法， 但是，这两种方法对于检测禁用药物在灵敏度上常常达不到要求。以化学发光免疫分析 (Chemiluminescencelmmunoassay, CLIA)为代表的快速筛选法为免疫学主流技术，但目前 国内外尚无利用化学发光免疫分析(CLIA)方法检测呋喃唑酮代谢物AOZ的报道。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种呋喃唑酮代谢物AOZ的化学发光免疫分析 (CLIA)试剂盒，该试剂盒不仅可以实现快速、大批量检测，而且检测特异性和灵敏度显著提尚ο此外，还需要提供一种上述试剂盒的检测方法。为了解决上述技术问题，本专利技术通过如下技术方案实现在本专利技术的一个方面，提供了一种呋喃唑酮代谢物检测试剂盒，包括检测板、试 齐 ，所述试剂包括抗体、检测目标物标准溶液，所述检测目标物为呋喃唑酮代谢物3-氨 基-2-恶唑烷酮的对硝基苯化衍生物4-ΝΡΑ0Ζ。该4-ΝΡΑ0Ζ通过在乙醇中加入AOZ和对硝基苯甲醛反应制得，其反应方程式如下 <formula>formula see original document page 4</formula>优选的，所述抗体是用呋喃唑酮代谢物3-氨基-2-恶唑烷酮衍生化半抗原与载体 蛋白的偶联物作为免疫原制备出的单克隆抗体。免疫原采用AOZ衍生化半抗原与载体蛋白的偶联物，是因为抗体制备时，只有抗 原分子量较大的化合物(> 5000D)注射到动物体内时才能诱导动物体内产生抗体。如果 是小分子量的化合物(这类化合物叫半抗原)，不能直接诱导动物产生抗体，而为了制得抗 体，需将该小分子化合物偶联于大分子载体(如牛血清白蛋白，BSA)上制得抗原，再将其用 于免疫动物，制备抗体。所述呋喃唑酮代谢物AOZ衍生化半抗原是呋喃唑酮代谢物AOZ与对醛基苯甲酸反 应所得的衍生物4-CPA0Z，4-CPA0Z的化学结构式如下<formula>formula see original document page 4</formula>所述载体蛋白包括牛血清白蛋白、卵清白蛋白、兔血清白蛋白、人血清白蛋白、人 血纤维蛋白或血蓝蛋白。优选的，所述载体蛋白为牛血清白蛋白。优选的，所述检测板为化学发光板，适用于化学发光免疫分析检测。所述检测板的各孔包被有包被抗原，该包被抗原为呋喃唑酮代谢物3-氨基-2-恶 唑烷酮衍生化半抗原与卵清白蛋白的偶联物，所述呋喃唑酮代谢物AOZ衍生化半抗原是上 述呋喃唑酮代谢物AOZ与对醛基苯甲酸反应所得的衍生物4-CPA0Z。本专利技术采用呋喃唑酮代谢物AOZ衍生化半抗原与卵清白蛋白偶联物作为抗原包 被检测板各孔，然后加入经对硝基苯甲醛衍生化前处理过的待测样品和抗呋喃唑酮代谢物 AOZ衍生化半抗原单克隆抗体，让包被抗原和待测样品两者竞争抗体以检测样品中的AOZ 衍生物4-NPA0Z。优选的，本专利技术试剂盒中的试剂还包括酶标二抗，该酶标二抗包括辣根过氧化物 酶标记的羊抗小鼠IgG浓缩液。优选的，本专利技术试剂盒中的试剂还包括底物反应液，该底物反应液包含Tris-HCl 缓冲液、鲁米诺、对羟基苯丙烯酸和过氧化氢。优选的，本专利技术试剂盒中的试剂还包括衍生剂，该衍生剂为对硝基苯甲醛，用于待 测样品的衍生化前处理。在本专利技术的另一方面，还提供了一种呋喃唑酮代谢物的检测方法，包括以下步 骤前处理待测样品；用上述试剂盒检测样品；分析检测结果。本专利技术呋喃唑酮代谢物检测试剂盒，具有下列优点(1)特异性强，敏感性高，安全性好。本专利技术检测呋喃唑酮代谢物AOZ化学发光免 疫分析(CLIA)试剂盒以4-NPA0Z为检测目标物，该4-NPA0Z检测目标物与半抗原4-CPA0Z 的主体结构一致，能与呋喃唑酮代谢物AOZ衍生物(4-CPA0Z-BSA)的单克隆抗体特异性结 合，结合效率和灵敏度都比目前常用的2-NPA0Z检测目标物更高。而且，本专利技术试剂盒中 的单克隆抗体不含针对载体蛋白的抗体，只与相应呋喃唑酮代谢物AOZ衍生化检测目标物 4-NPA0Z结合或者同时与含AOZ及苯环结构的相关修饰物极少量结合，不与动物其它抗生 素药物和消毒药发生交叉反应。因此，本专利技术试剂盒具有很高的特异性和敏感性，检测灵敏 度达 0. 005ppbo(2)操作简便快速。使用抗呋喃唑酮代谢物AOZ衍生化半抗原单克隆抗体化学发 光免疫分析试剂盒检测呋喃唑酮代谢物AOZ时，无需另配其它试剂，样品无需无菌处理，按 试剂盒说明在3-4小时内即可判定检测结果。(3)结果判定准确、可靠。本专利技术呋喃唑酮代谢物AOZ化学发光免疫分析检测试剂 盒以多功能酶标仪机读数定量显示检测结果，减少主观性，准确可靠。(4)成本低，投资少。本专利技术呋喃唑酮代谢物AOZ化学发光免疫分析检测试剂盒可 批量检测，一步到位，成本低廉，投资少，见效快。附图说明下面结合附图和具体实施方式对本专利技术作进一步详细的说明。图1是本专利技术实施例3检测样品的标准曲线图；图2是本专利技术实施例3中试剂盒变异系数的柱状图。具体实施例方式本专利技术检测呋喃唑酮代谢物AOZ化学发光免疫分析(CLIA)试剂盒，包括检测 板、试剂，该试剂包括抗体、检测目标物标准溶液，该检测目标物为呋喃唑酮代谢物3-氨 基-2-恶唑烷酮的对硝基苯化衍生物4-NPA0Z。运用本专利技术试剂盒检测动物源性食品中呋喃唑酮代谢物Α0Ζ，能显著提高检测灵 敏度，其检测分析原理是化学发光本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种呋喃唑酮代谢物检测试剂盒，包括检测板、试剂，所述试剂包括抗体、检测目标物标准溶液，其特征在于，所述检测目标物为呋喃唑酮代谢物３－氨基－２－恶唑烷酮的对硝基苯化衍生物４－ＮＰＡＯＺ。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王权，李健，陈沁，徐仙，陈永军，蒋蔚，赵新宇，顾惠明，
申请(专利权)人：中国农业科学院上海兽医研究所，中华人民共和国上海出入境检验检疫局，上海大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]