一种耐盐碱基因去除标记重组质粒载体制造技术

一种耐盐碱基因去除标记重组质粒载体，属于植物转基因技术领域，是用ＳＫＣ１及３５Ｓ启动子替换了基础载体ＰＸ６－ＧＦＰ的ＧＦＰ序列而构建成的，这个基因位于载体Ｔ－ＤＮＡ左边界ＬＢ和右边界ＲＢ序列之间，它含有的ＸＶＥ杂合蛋白与诱导物１７－β－雌二醇结合后可启动重组酶ＣＲＦ的表达，从而剔除选择标记，启动子为人工启动子Ｇ１０－３５Ｓ，目的基因是耐盐性基因ＳＫＣ１。本发明专利技术的载体转化率较高；并且本发明专利技术获得的转基因玉米具有较好的耐盐碱特性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术构建了一种安全的植物抗逆表达载体，并实现含有目的基因(SKCl)的该 载体在植物中的耐盐性表达。本专利技术属于植物转基因

技术介绍
自从1983年世界上诞生第一例转基因植株以来，转基因作物的安全性曾经在全 球范围引起很大争议，一个主要的原因足在转基因操作过程中的初期，为了筛选转基因细 胞，用于植物表达的载体往往含有抗生素基因和除草剂基因，而当筛选得到目的细胞后，抗 生素基因就没有用途了，但它在转基因材料中的存在会特来环境和食品上的安全隐患。因 此，近些年来植物转基因研究的热点之一就是实现安全性标记，其中位点特异性重组系统 研究得最多也最深入，Cre/Loxp系统是这类之一。Cre/loxp位点特异性重组系统是Steinberg等首先在大肠杆菌噬菌体pi中发现 的，由Cre重组酶和Ioxp位点两部分组成。Cre重组酶是噬菌体pi编码的分子量为38. 5kD 蛋白质，由1029个核营酸序列编码，能识别并催化Ioxp位点的分子内(切除、倒位)和分 子间(易位)的特异性重组。在研究Cre重组酶的结构与功能过程中，Guo等发现该酶由折叠成较小的N —末 端和较大的C 一末端两个结构域组成，结构域间通过一个较短的分隔区相连。两个结构域 在结合位点周围形成“夹子”结构，以和DNA分子的大小沟部位充分接触。N —末端和序列 的识别有关，由第20-120个氨基酸组成，包含5个a-螺旋(A，B，C，D，E)。其中螺旋C，D，E 形成反平行束，A，B螺旋垂直于3个反向平行束。螺旋B，D与DNA的大沟相连，螺旋A，E与 Cre重组酶四聚体的形成有关。C 一末端和DNA的结合及DNA链的切割有关，由第132-341 氨基酸组成，包含9个a-螺旋(F，G，H，I，J，K，L，M，N)，螺旋间有2个小的β —折叠片结 构。C末端和DNA的接触面复杂，大部分的螺旋和连接环均与DNA分子的大小沟及主链部位 相互作用。M和L形成一个疏水区，是Cre重组酶的主要活性中心。螺旋N远离其他螺旋， 有助于Cre亚基间相互接触。在重组反应中，与2个Ioxp位点结合的不同Cre亚基N —端 结构相似，而分子间C 一末端构象有很明显的差异，这说明不同Cre亚基在重组过程中所起 的作用不同。Ioxp位点是Cre重组酶介导重组反应时的识别位点，长34bp，包括8bp的间隔序 列及两个13bp的反向重复序列。8bp间隔序列是Ioxp位点中唯一的不对称部位，其中8bp 的不对称间隔区是一段重要的核营酸序列，重组过程中DNA链中DNA的切割和连接均在此 部位进行。8bp的间隔区从功能上可分为以下3个部分6，7位是第一次链的交换和连接所 必需的；2，5位的4个碱基是第二次链的交换所必需的；1，8位的碱基改变后，如果与野生 型Ioxp位点组合，不会影响重组反应的效率；如果2个Ioxp位点均为突变型，重组效率将 大大降。Cre重组酶与Loxp位点的反应机制已做了非常深入的研究，其作用机制是一个识 别、切割、重组、连接、分离的过程，重组反应是在DNA的两个Ioxp位点间，过程中没有DNA3的合成和丢失，既可以发生在体内、体外的细胞中，也可以在无细胞体系进行。发生反应时 每分子的Cre重组酶结合一个Ioxp位点的反向重复区，即4个Cre重组酶与2个Ioxp位 点结合，形成一个联会复合体结构，其中2个Cre重组酶分子具有重组活性，另外2个没有 重组活性。Cre重组酶先和DNA结合，但开始结合力较弱，当遇到Ioxp位点时结合力大大增 强，当有2个Ioxp时结力更强。然后C末端保守的酪氨酸(Tyr-324)与DNA分子的3’_P04 结合形成3’ 一磷酸酪氨酸，导致DNA链的切割；切割后产生的5' -OH既可与同一断裂部 位的3’_P04结合恢复为原来的构型，也可与另一切割部位的3’_P04结合发生链的交换，形 成一个“Holliday结构”的中间产物；继而产生结构的异构化，这时第一次切割的2个Cre 酶不再起切割作用，而是由另外2个Cre酶进行第二次链的切割和交换，去掉中间产物发生 重组，这样便完成了基因的插入或删除。Ioxp位点的8bp非对称间隔区决定了重组反应的模式，位点特异性重组酶系统根 居识别位点方向和位置的不同，能够产生3种效应，分别为①当一对反向识别位点位于目的基因的两端时，在对应重组酶的作用下，识别位 点间的所有基因将发生倒置，即倒位(Inversion)。②当一对同向识别位点位于目的基因的两端时，其相应的重组酶将删除识别位点 之间的所有外源基因和一个识别位点，最后在基因组中只留下一个识别位点，这就是重组 (Recombination) 0③如果识别位点分别位于细胞中不同的染色体上，那么在对应重组酶的作用下， 两条染色体可以在识别位点的位置发生染色体片段的互换，产生杂合的染色体，这种作用 就叫作位置互换(Translocation)。
技术实现思路
本专利技术公开一种安全的植物抗逆表达载体，目的是为培育环境安全、抗逆性优良 的转基因植物提供一种有效的表达载体。用该载体转化植物，可以有效剔除选择标记，筛选 获得耐盐碱转基因植物。本专利技术的安全性植物抗逆表达载体，其特征是用SKCl及35S启动子替换了基础载体PX6-GFP的GFP序列而构建成的，这个 基因位于载体T-DNA左边界LB和右边界RB序列之间，它含有的XVE杂合蛋白与诱导物 17- β -雌二醇结合后可启动重组酶CRE的表达，从而剔除选择标记，启动子为人工启动子 G10-35S，目的基因是耐盐性基因SKCl。本载体中的启动子是35S，这个启动子克隆于ΡΒΙ121。本专利技术的安全性耐盐碱植物表达载体转化大肠杆菌DH5 α，获得含有该载体的大 肠杆菌转化子。本专利技术的安全性耐盐碱植物表达载体转化农杆菌ΕΗΑ105，获得含有该载体的农杆 菌转化子，利用该转化子，可以获得环境安全耐盐碱的转基因植物。实验证明，本专利技术的载体转化率较高；并且本专利技术获得的转基因玉米具有较好的 耐盐碱特性。具体实施例方式为了便于理解本专利技术，特例举以下实施例。其作用被理解为是对本专利技术的阐释而 非对本专利技术的任何形式的限制。实施例1 安全性植物抗逆表达载体PX6-35S-SKC1的构建首先将质粒PX6-GFP中的GFP替换成启动子35S(启动子片段来源于PBI121 其 构建过程是PCR法扩增出PBI121中的35S的核苷酸序列，连接入PX6-GFP载体得到的。) 用SpeI、XhoI双酶切除PX6-GFP的GFP启动子，在切除的GFP位置连接入35S启动子，获得 中间载体PX6-35S。用SpeI单酶切载体PSK-SKCl，获得两端带有SpeI酶切位点的SKCl基因。再用SpeI单酶切中间载体PX6-35S。载体构建的最后一步将两个反应连接。表1. 1、表1. 2和表1. 3是上述实验涉及到的酶切反应体系，电泳条件和连接反应 体系。表1. 1 HindIII和KpnI双酶切反应和电泳体系 37°C 反应过夜，然后用 1XTAE(0. 04mol/L Tris-乙酸，0. OOlmol/LEDTA)配制 0. 8%琼脂糖凝胶，在琼脂糖凝胶内加入EB (溴化乙锭)至终浓度为0. 5 μ g/ml，在5V/cm的 电压下电泳。表1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种耐盐碱基因去除标记重组质粒载体，其特征是：用ＳＫＣ１及３５Ｓ启动子替换了基础载体ＰＸ６－ＧＦＰ的ＧＦＰ序列而构建成的，这个基因位于载体Ｔ－ＤＮＡ左边界ＬＢ和右边界ＲＢ序列之间，它含有的ＸＶＥ杂合蛋白与诱导物１７－β－雌二醇结合后可启动重组酶ＣＲＥ的表达，从而剔除选择标记，启动子为人工启动子Ｇ１０－３５Ｓ，目的基因是耐盐性基因ＳＫＣ１。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：于志晶，林秀峰，李淑芳，马瑞，
申请(专利权)人：吉林省农业科学院，
类型：发明
国别省市：82[中国|长春]