粪便宏基因组来源的谷氨酸脱羧酶及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了粪便宏基因组来源的谷氨酸脱羧酶及其制备方法和应用，属于基因工程技术领域，所述谷氨酸脱羧酶的氨基酸序列如

【技术实现步骤摘要】
粪便宏基因组来源的谷氨酸脱羧酶及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及基因工程
，具体涉及粪便宏基因组来源的谷氨酸脱羧酶及其制备方法和应用
。

技术介绍

[0002]谷氨酸脱羧酶
(GAD
，
EC 4.1.1.15)
是催化
L
‑
谷氨酸脱羧获得
γ
‑
氨基丁酸
(GABA)
的关键酶，属于磷酸吡哆醛
(PLP)
依赖性酶
。GABA
是哺乳动物中枢神经系统的主要抑制性神经递质，与调节突触传递
、
降低血压
、
抗氧化等有关
。
研究证实，肠道微生物产生的
GABA
与宿主的健康和疾病密切相关，是调节肠
‑
脑
‑
轴通讯的重要神经递质，其介导的神经传递调节宿主的多种疾病
。GABA
作为一种生物活性因子，被广泛应用于医疗
、
食品和饲料等行业
。
[0003]目前利用微生物发酵生产
γ
‑
氨基丁酸具有生产周期短
、
成本低
、
安全性高的优点，但可培养微生物来源的谷氨酸脱羧酶在热和酸碱条件下不够稳定
。
因此，从不同环境微生物中获得稳定性强的谷氨酸脱羧酶，不断提高
γ
‑
氨基丁酸的转化率，对于高效合成谷氨酸脱羧酶具有重要意义
。
[0004]基于此，本专利技术设计了粪便宏基因组来源的谷氨酸脱羧酶及其制备方法和应用以解决上述问题
。

技术实现思路

[0005]针对现有技术所存在的上述缺点，本专利技术提供了粪便宏基因组来源的谷氨酸脱羧酶及其制备方法和应用
。
[0006]为实现以上目的，本专利技术通过以下技术方案予以实现：
[0007]一种粪便宏基因组来源的谷氨酸脱羧酶，氨基酸序列如
SEQ ID NO.2
所示
。
[0008]一种粪便宏基因组来源的谷氨酸脱羧酶的编码基因，核苷酸序列如
SEQ ID NO.1
所示
。
[0009]一种重组载体，包含所述的编码基因
。
[0010]一种重组菌，包含所述的编码基因
。
[0011]更进一步的，重组菌株为
BL21(DE3)/Xby1_8。
[0012]一种粪便宏基因组来源的谷氨酸脱羧酶的制备方法，包括以下步骤：
[0013]1)
筛选克隆谷氨酸脱羧酶基因；
[0014]2)PCR
扩增，得到谷氨酸脱羧酶基因；
[0015]3)
将谷氨酸脱羧酶基因的重组表达载体转化宿主细胞得到重组菌株，培养重组菌株，诱导重组谷氨酸脱羧酶表达；
[0016]4)
回收并纯化所表达的谷氨酸脱羧酶，得到谷氨酸脱羧酶
。
[0017]更进一步的，从宏基因组中筛选谷氨酸脱羧酶，把宏基因组
DNA
作为模板进行
PCR
扩增，得到谷氨酸脱羧酶基因
。
[0018]更进一步的，以
SEQ ID NO.3
所示的引物
Xby1_8
‑
F
和
SEQ ID NO.4
所示的引物
Xby1_8
‑
R
进行
PCR
扩增
。
[0019]一种粪便宏基因组来源的谷氨酸脱羧酶在重组大肠杆菌全细胞合成
γ
‑
氨基丁酸中的应用
。
[0020]有益效果
[0021]本专利技术提供了一种粪便微生物宏基因组来源的谷氨酸脱羧酶，其氨基酸序列如
SEQ ID NO.2
所示，共
479
个氨基酸，理论分子量为
54.46kDa。
所述的谷氨酸脱羧酶最适作用
pH
为
5.0
，在
pH4.0
‑
8.0
范围内处理
1h
后，剩余酶活高于
100
％；最适作用温度为
60℃
，在
30
，
35
，
40
，
45
，
50℃
条件下耐受
1h
，剩余酶活高于
100
％，该谷氨酸脱羧酶具有良好的热稳定性，是典型的热稳定性酶
。
在最适条件下，该酶的比活为
3106.23U/mg
，高于其他微生物来源的谷氨酸脱羧酶
。
[0022]本专利技术的谷氨酸脱羧酶可应用于重组大肠杆菌全细胞高效合成
γ
‑
氨基丁酸，在工业
、
食品等方面具有潜在的应用价值
。
附图说明
[0023]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍
。
显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图
。
[0024]图1是本专利技术实施例提供的在大肠杆菌中表达的谷氨酸脱羧酶
Xby1_8
的
SDS
‑
PAGE
分析；其中，
M
：低分子量蛋白质
Marker
；1：仅含有
pEASY
‑
E2
载体的大肠杆菌诱导后的粗酶；2：未纯化的重组谷氨酸脱羧酶；3：纯化的谷氨酸脱羧酶；
[0025]图2是本专利技术实施例提供的重组谷氨酸脱羧酶的最适
pH
结果；
[0026]图3是本专利技术实施例提供的重组谷氨酸脱羧酶的
pH
稳定性结果；
[0027]图4是本专利技术实施例提供的重组谷氨酸脱羧酶的最适温度结果；
[0028]图5是本专利技术实施例提供的重组谷氨酸脱羧酶的温度稳定性结果；
[0029]图6是本专利技术实施例提供的谷氨酸脱羧酶重组大肠杆菌全细胞合成
GABA
的最适
pH
结果；
[0030]图7是本专利技术实施例提供的谷氨酸脱羧酶重组大肠杆菌全细胞合成
GABA
的最适温度结果；
[0031]图8是本专利技术实施例提供的谷氨酸脱羧酶重组大肠杆菌全细胞合成
GABA
的最适
PLP
浓度结果；
[0032]图9是本专利技术实施例提供的谷氨酸脱羧酶重组大肠杆菌全细胞合成
GABA
的最适底物浓度结果；...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种粪便宏基因组来源的谷氨酸脱羧酶，其特征在于，氨基酸序列如
SEQ ID NO.2
所示
。2.
一种根据权利要求1所述的粪便宏基因组来源的谷氨酸脱羧酶的编码基因，其特征在于，核苷酸序列如
SEQ ID NO.1
所示
。3.
一种重组载体，其特征在于，包含权利要求2所述的编码基因
。4.
一种重组菌，其特征在于，包含权利要求2所述的编码基因
。5.
根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于，重组菌株为
BL21(DE3)/Xby1_8。6.
一种根据权利要求1所述的粪便宏基因组来源的谷氨酸脱羧酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)
筛选克隆谷氨酸脱羧酶基因；
2)PCR
扩增，得到谷氨酸脱羧酶基因；
3)
将谷氨酸脱羧酶基因的重组表达载体转化宿主细胞得到重组菌株，培养重组菌...

【专利技术属性】
技术研发人员：许波，陈红，黄遵锡，
申请(专利权)人：云南师范大学，
类型：发明
国别省市：