一种磁珠及其制备方法及在细胞外囊泡提取中的应用技术

本发明专利技术提供了一种磁珠及其制备方法及在细胞外囊泡提取中的应用，解决现有细胞外囊泡分离方法所存在的成本高

【技术实现步骤摘要】
一种磁珠及其制备方法及在细胞外囊泡提取中的应用


[0001]本专利技术属于生物分离
，具体涉及一种磁珠及其制备方法及在细胞外囊泡提取中的应用
。

技术介绍

[0002]细胞外囊泡是细胞内多泡体与细胞膜融合后，释放到细胞外基质中的模型囊泡，包含了复杂
RNA
和蛋白质，比如：外泌体
。1983
年，细胞外囊泡首次于绵羊网织红细胞中被发现，在当时被认为是细胞排泄废物的一种方式
。2007
年，人们发现鼠的肥大细胞分泌的细胞外囊泡可以被人的肥大细胞捕获，并且其携带的
mRNA
可以被翻译成蛋白质；并且细胞外囊泡所转移的
microRNA
同样具有生物活性，能够在进入靶细胞后调节细胞中
mRNA
的水平，它还能够通过循环系统到达其他细胞与组织，产生远程调控作用
。
细胞外囊泡所体现出的广阔的应用前景，引发研究人员的研究热情
。
[0003]但由于细胞外囊泡多分布在复杂的体液环境中，如血液
、
尿液
、
唾液等，且体积小
、
数量少，细胞外囊泡的分离纯化是一道难题
。
目前，可用于有效分离细胞外囊泡的方法有以下几种：超速离心法
、
密度梯度离心法
、
沉淀法
、
超滤法
、
磁珠免疫法
、
色谱法
。
[0004]其中，超速离心法是细胞外囊泡分离的金标准方法，利用分离物质的沉降系数差异大将细胞碎片
、
蛋白等除去，然后以
100000
×
g
超速离心分离
70min
得到所需的细胞外囊泡；但该方法耗时长
、
依赖于昂贵设备，此外超速离心过程可能导致大量细胞外囊泡的丢失，降低得率，因而需要改进细胞外囊泡提取方法，降低提取所需成本和时间
。
[0005]密度梯度离心法是在超速离心力作用下，使蔗糖溶液形成从低到高连续分布的密度阶层，是一种区带分离法，此法获得的细胞外囊泡纯度较高，但步骤繁琐
、
耗时
。
[0006]沉淀法是将溶剂添加到溶液中来改变某些组分的极性和溶解度，从而使它们沉淀到溶液中，但会对细胞外囊泡的纯度有影响
。
[0007]超滤法是利用不同截留相对分子质量的超滤膜对样品进行选择性分离，便可获得细胞外囊泡，简单高效，且不影响细胞外囊泡的生物活性，但存在纯度不高的问题
。
[0008]磁珠免疫法是用包被抗标记物抗体的磁珠与细胞外囊泡囊泡孵育结合，细胞外囊泡表面有其特异性标记物，因而可将细胞外囊泡吸附并分离出来，具有特异性高
、
操作简便，不影响细胞外囊泡形态完整等特点，但是效率低，不利于下游实验，难以广泛普及
。
[0009]色谱法则是将样品添加到色谱柱的一端，使其吸附和溶解在固定相上，然后使用冲洗剂将样品从固定相上分离，但需要特殊的设备，且会降低得率
。
[0010]鉴于上述细胞外囊泡分离方法或多或少存在问题，本专利技术研究团队认为有必要探究一种更加有效的细胞外囊泡分离方法
。

技术实现思路

[0011]本专利技术的目的在于解决现有细胞外囊泡分离方法所存在的不足之处，而提供了一种磁珠及其制备方法及在细胞外囊泡提取中的应用
。
[0012]为实现上述专利技术目的，本专利技术所提供的技术解决方案是：
[0013]一种微纳米磁珠，其特殊之处在于：以片状磁性氧化石墨烯为基底，其结合位点上结合有聚乙二醇，尺寸为
10
‑
50
μ
m。
[0014]上述微纳米磁珠的制备方法，其特殊之处在于，包括以下步骤：
[0015]1)
制备磁性氧化石墨烯
[0016]1.1)
将单层氧化石墨烯
(
可选择工业用
)
分散在乙二醇中，得到氧化石墨烯溶液；
[0017]1.2)
向步骤
1.1)
得到的氧化石墨烯溶液中加入三氯化铁
、
乙酸钠和聚乙二醇
8000
，混合搅拌后，加热进行反应
(
高温高压反应
)
；
[0018]1.3)
待步骤
1.2)
反应结束后离心收集产物，并用乙醇和水
(
超纯水
、
去离子水均可
)
依次磁吸洗涤，真空干燥得到磁性氧化石墨烯；
[0019]2)
制备微纳米磁珠
[0020]2.1)
将步骤
1)
得到的磁性氧化石墨烯溶解在
N,N
‑
二甲基甲酰胺
(DMF)
溶剂中，进行第一次超声处理；
[0021]2.2)
向步骤
2.1)
得到的溶液中加入聚乙二醇
200(PEG
‑
200)
，进行第二次超声处理；
[0022]2.3)
向步骤
2.2)
得到的溶液中加入二环己基碳二亚胺
(DCC)
和4‑
二甲氨基吡啶
(DMAP)
，进行第三次超声处理，之后加热进行反应；
[0023]2.4)
待步骤
2.3)
反应结束后采用乙醇和水依次洗涤
、
真空干燥制得微纳米磁珠，即结合聚乙二醇的磁性氧化石墨烯
。
[0024]步骤
1)
中采用单层氧化石墨烯和乙二醇具有优良的分散性，通过步骤
1)
方法制备得到的磁性氧化石墨烯能够兼备良好的分散性和亲水性，并且不影响后续配体的结合，而采用聚乙二醇
200
作为配体，更有利于得到配体分布均匀且结合效果好的微纳米磁珠
。
[0025]进一步地，步骤
1.2)
中，所述单层氧化石墨烯和乙酸钠的质量比为
1∶20
‑
80
，优选范围为
1∶30
‑
40
，优选值为
1∶35
；
[0026]所述单层氧化石墨烯和三氯化铁的质量比为
1∶2
‑
10
，优选范围为
1∶4
‑5，优选值为
1∶4
；
[0027]所述单层氧化石墨烯和聚乙二醇
8000
的质量比为
1∶1
‑5，优选范围为
1∶2
‑3，优选值为
1∶2
；
[0028]按照优选范围制备出的磁性氧化石墨烯的分散性和磁性效果均更好，优选值效果本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种微纳米磁珠，其特征在于：以磁性氧化石墨烯为基底，其结合位点上结合有聚乙二醇
。2.
权利要求1所述微纳米磁珠的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)
制备磁性氧化石墨烯
1.1)
将单层氧化石墨烯分散在乙二醇中，得到氧化石墨烯溶液；
1.2)
向步骤
1.1)
得到的氧化石墨烯溶液中加入三氯化铁
、
乙酸钠和聚乙二醇
8000
，混合搅拌后，加热进行反应；
1.3
待步骤
1.2)
反应结束后离心收集产物，并用乙醇和水依次磁吸洗涤，真空干燥得到磁性氧化石墨烯；
2)
制备微纳米磁珠
2.1)
将步骤
1)
得到的磁性氧化石墨烯溶解在
N,N
‑
二甲基甲酰胺中，进行第一次超声处理；
2.2)
向步骤
2.1)
得到的溶液中加入聚乙二醇
200
，进行第二次超声处理；
2.3)
向步骤
2.2)
得到的溶液中加入二环己基碳二亚胺和4‑
二甲氨基吡啶，进行第三次超声处理，之后加热进行反应；
2.4)
待步骤
2.3)
反应结束后洗涤
、
真空干燥制得微纳米磁珠
。3.
根据权利要求2所述制备方法，其特征在于：步骤
1.2)
中，所述单层氧化石墨烯和乙酸钠的质量比为
1∶20
‑
80
；所述单层氧化石墨烯和三氯化铁的质量比为
1∶2
‑
10
；所述单层氧化石墨烯和聚乙二醇
8000
的质量比为
1∶1
‑
5。4.
根据权利要求2或3所述所述制备方法，其特征在于：步骤
1.2)
中，混合搅拌至少1小时；...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔宁，党心敏，
申请(专利权)人：苏州宁饶生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：