一种基于制造技术

本发明专利技术公开了一种基于

【技术实现步骤摘要】
一种基于RT
‑
RPA与CRISPR技术的猪流感和蓝耳病试纸条检测系统


[0001]本专利技术涉及兽医学
，具体是指一种基于
RT
‑
RPA
与
CRISPR
技术的猪流感和蓝耳病试纸条检测系统
。

技术介绍

[0002]猪繁殖与呼吸综合征病毒
(PRRSV)
为单股正链
RNA
病毒，属于动脉炎病毒科
。PRRSV
毒株间的高度变异和重组使该病的防控极为复杂，给养猪业造成了巨大的经济损失
。
甲型流感病毒
(IAV)
是导致猪和人类呼吸道疾病最重要的病原之一
。
人源和猪源
IAV
表现出一种特殊的种间传播形态，导致定期和偶尔持续性的互相传播
。
猪源
IAV
的多样性是诊断和控制
IAV
的关键因素，其存在造成重大公共健康风险的可能
。
[0003]目前这两种病毒的诊断方法主要依赖于基于核酸的检测，即逆转录
‑
聚合酶链式反应
(RT
‑
PCR)
和逆转录
‑
荧光定量
PCR(RT
‑
qPCR)。
尽管基于
PCR
的诊断方法在各种类型病毒的检测中具有敏感
、
特异和简单的优势，但这些诊断方法有极大的限制，需要熟悉实验室操作的相关人员和相应的实验室设备，因此不适合在现场或基层实验室使用
。
[0004]自细菌和古细菌中发现的
CRISPR
‑
Cas
系统已被用于开发快速和便携的诊断方法，其具有更高的特异性
。Cas12a
利用与靶
DNA
序列互补的向导
RNA(gRNA)
和靶标上富含
T
核苷酸的原间隔序列相邻基序
(PAM)
识别其靶
DNA。
识别后，激活的
Cas12a
不仅催化目标
DNA
的切割，而且还促进非特异性单链
DNA
切割
。
基于
Cas12a
的反式切割活性和恒温核酸扩增技术，学者建立了
DNA
内切酶靶向
CRISPR
反式报告基因
(DETECTR)
的检测方法，已成功应用于快速
、
特异地检测临床标本中的人乳头状瘤病毒
(HPV)。CRISPR/Cas13a
通过
CRISPRRNA(crRNA)
识别靶
RNA
激活后，可以切割附近的非特异报告
RNA。Sherlock
是一个基于
Cas13a
的分子检测平台，它是通过
RPA
扩增和
T7
转录将扩增的
DNA
转录成
RNA
和
CRISPR/Cas13a
的并存效应相结合的方式建立的，可以通过结合侧向流动试纸条来实现视觉读数
。
基于
CRISPR/Cas13a
的检测已成功应用于寨卡病毒
(ZIKV)、
登革热病毒
(DENV)、
甲型禽流感
(H7N9)
病毒
、
埃博拉病毒以及其他分子的检测
。

技术实现思路

[0005]本专利技术要解决的技术问题是克服上述缺陷，提供一种对两种临床常见抗原核酸的高灵敏
、
高特异
、
高灵敏检测，适用于基层兽医站及临床快速检测，结果稳定可靠的基于
RT
‑
RPA
与
CRISPR
技术的猪流感和蓝耳病试纸条检测系统
。
[0006]为解决上述技术问题，本专利技术提供的技术方案为：一种基于
RT
‑
RPA
与
CRISPR
技术的猪流感和蓝耳病试纸条检测系统，包括：
RT
‑
RPA
引物对
、Cas12a
蛋白
、Cas13a
蛋白和对应的
crRNA。
[0007]一种基于
RT
‑
RPA
与
CRISPR
技术的猪流感和蓝耳病试纸条检测方法，包括以下步骤：
[0008](1)
将提取的样品
RNA
经过逆转录酶转录后，使用
RPA
‑
PRRSV
‑
F/R、RPA
‑
IAV
‑
F/R
通过商品化
RPA
试剂盒扩增特异性片段；
[0009](2)
加入
Cas12a/Cas13a
混合系统后
crRNA
识别特异序列并与之结合，激活
Cas12a/Cas13a
酶活性；
[0010](3)
切割相应的探针，滴加到测流层析试纸条后，被不同的配体捕获
。
[0011]优选的，所述
RT
‑
RPA
引物对包括适用于
PRRSV
的
RPA
扩增引物和适用于
IAV
的
RPA
扩增引物
。
[0012]优选的，所述适用于
PRRSV
的
RPA
扩增引物包括
PRRSV
‑
RPA
‑
F
和
PRRSV
‑
RPA
‑
R。
[0013]优选的，所述对应的
crRNA
包括对应的
RPPSVcrRNA
及探针和对应的
IAVcrRNA
及探针，所述对应的
RPPSVcrRNA
及探针为
PcrRNA
和探针
RNA
‑
FAM
，所述对应的
IAVcrRNA
及探针为
IcrRNA
和探针
DNA
‑
FAM。
[0014]优选的，所述适用于
IAV
的
RPA
扩增引物包括
IAV
‑
RPA
‑
F
和
IAV
‑
RPA
‑
R。
[0015]本专利技术与现有技术相比的优点在于：本专利技术基于
RT
‑
RPA
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种基于
RT
‑
RPA
与
CRISPR
技术的猪流感和蓝耳病试纸条检测系统，其特征在于，包括：
RT
‑
RPA
引物对
、Cas12a
蛋白
、Cas13a
蛋白和对应的
crRNA。2.
根据权利要求1所述的一种基于
RT
‑
RPA
与
CRISPR
技术的猪流感和蓝耳病试纸条检测系统，其特征在于：所述
RT
‑
RPA
引物对包括适用于
PRRSV
的
RPA
扩增引物和适用于
IAV
的
RPA
扩增引物
。3.
根据权利要求1所述的一种基于
RT
‑
RPA
与
CRISPR
技术的猪流感和蓝耳病试纸条检测方法，其特征在于：所述适用于
PRRSV
的
RPA
扩增引物包括
PRRSV
‑
RPA
‑
F
和
PRRSV
‑
RPA
‑
R。4.
根据权利要求1所述的一种基于
RT
‑
RPA
与
CRISPR
技术的猪流感和蓝耳病试纸条检测方法，其特征在于：所述对应的
crRNA
包括对应的
RPPSVcrRNA
及探针和对应的
IAVcrRNA
及探针，所述对应的

【专利技术属性】
技术研发人员：张莹，冯亚莉，张世伟，李海玲，
申请(专利权)人：沈阳农业大学，
类型：发明
国别省市：