一种英夫利西的检测试剂及其制备方法和检测方法与应用技术

本申请涉及游离药物检测技术领域，具体公开一种英夫利西的检测试剂及其制备方法和检测方法与应用

【技术实现步骤摘要】
一种英夫利西的检测试剂及其制备方法和检测方法与应用


[0001]本申请涉及游离药物检测
，更具体地说，涉及一种英夫利西的检测试剂及其制备方法和检测方法与应用
。

技术介绍

[0002]肿瘤坏死因子
α
(TNF
‑
α
)
主要由巨噬细胞和
T
细胞产生，为一种肿瘤标志物，可用于排查恶性肿瘤
、
类风湿性关节炎等疾病
。
在急性和慢性炎症中，过量的
TNF
‑
α
起促进和维持炎症反应的核心作用
。
因此，慢性炎症性疾病，如克罗恩病
、
溃疡性结肠炎
、
类风湿或关节炎或牛皮癣，越来越多地使用抗
TNF
‑
α
抗体来治疗炎症
。
英夫利西单抗是一种靶向
TNF
‑
α
的治疗性抗体
。
抗
TNF
‑
α
抗体的临床疗效通常与治疗性抗体谷浓度水平相关
。
因此监测英夫利西单抗的血药浓度水平可以为提高疗效和安全性提供及时参照
。
[0003]目前英夫利西血药浓度监测在国内临床实践中开展很少，与英夫利西血药浓度检测方法繁琐
、
人们缺乏血药浓度监测的意识等有关
。
英夫利西的检测分析主要有
ELISA
法
(
酶联免疫吸附测定法
)
，
LC
‑
MS
法
(
液相色谱
‑
质谱联用检测法
)
，但
LC
‑
MS
法分析时间较长，操作复杂，难以满足临床检验对效率的高要求，
ELISA
法自动化程度低，测试时间长，满足不了临床高通量
、
快速准确的检测需求
。
[0004]一些检测单抗药物和抗单抗药物抗体浓度方法采用针对靶向
TNF
‑
α
的抗体药物的抗体作为捕获肽，以及生物素化的
TNF
‑
α
蛋白作为检测物，从原理上，所有的
TNF
‑
α
的抗体药物都会对同生物素化的
TNF
‑
α
蛋白发生反应，对检测试剂产生干扰，从而影响检测的特异性
。
[0005]目前缺乏高特异性
、
高灵敏度的
、
简单快速
、
自动化程度高的英夫利西游离血药浓度检测方法
。

技术实现思路

[0006]针对目前缺乏高特异性
、
高灵敏度的
、
简单快速
、
自动化程度高的英夫利西游离血药浓度检测方法的状况，本申请提供一种英夫利西游离药物检测试剂及其制备方法和检测方法，本申请采用双抗体夹心法测定英夫利西游离药物浓度
。
[0007]第一方面本申请提出一种英夫利西的检测试剂的制备方法，并采用如下技术方案
。
[0008]一种英夫利西的检测试剂的制备方法，包括：制备英夫利西
(Fab)2
片段作为抗原；使用所述抗原引发免疫反应，筛选得到能与所述抗原结合的捕获抗体和检测抗体；取所述捕获抗体和链霉亲和素磁珠反应得到磁微粒工作液；取所述检测抗体和碱性磷酸酶偶联反应得到酶标工作液；所述磁微粒工作液
、
所述酶标工作液和发光指示剂作为所述英夫利西的检测试
剂；所述催化酶能催化所述发光指示剂发光
。
[0009]通过采用上述技术方案，磁微粒工作液可以先和抗原反应结合，再加入酶标工作液和已结合在磁微粒上的抗原结合，最后加入发光指示剂进行显色，通过设计两种抗体均要能结合抗原，达到特异性筛选抗原的效果，通过发光参数得出抗原的准确浓度
。
制备得到的检测试剂对其他多种
TNF
‑
α
靶向药物不发生结合，而能特异性的结合英夫利西，特异性高
。
通过配置磁微粒工作液
、
酶标工作液和发光指示剂的结合量，可以准确定性定量英夫利西
。
[0010]作为该英夫利西的检测试剂的制备方法的一种改进，所述制备英夫利西
(Fab)2
片段，包括：将英夫利西溶解，加入
(Fab)2
特异性剪切酶，孵育，去除未反应的英夫利西，去除从英夫利西切割下的
Fc
段以及去除所述
(Fab)2
特异性剪切酶，收集含有英夫利西
(Fab)2
片段的剩余物
。
所述
(Fab)2
特异性剪切酶为
IdeZ
蛋白酶
、IdeS
蛋白酶或胃蛋白酶
。
[0011]通过采用上述技术方案，上述的
(Fab)2
特异性剪切酶能精准的将英夫利西剪切成
(Fab)2
片段和
Fc
段，除去杂物得到只含英夫利西
(Fab)2
片段的物质
。
[0012]作为该英夫利西的检测试剂的制备方法的一种改进，将英夫利西和
(Fab)2
特异性剪切酶孵育后的液体先通过抗体纯化柱，来去除未反应的英夫利西和去除从英夫利西中切割下的
Fc
片段，再通过
Ni
亲和层析柱，来去除所述
(Fab)2
特异性剪切酶
。
[0013]通过采用上述技术方案，该抗体纯化柱可以是
ProteinA
柱
。
剪切反应物过这两种柱子后得到净化的
(Fab)2
片段，减小试验干扰
。
[0014]作为该英夫利西的检测试剂的制备方法的一种改进，所述捕获抗体和所述检测抗体，通过以下方式得到：取英夫利西
(Fab)2
片段，加入弗氏完全佐剂，得到第一乳化液，将所述第一乳化液注入试验动物体内进行首次免疫；继续取英夫利西
(Fab)2
片段，加入弗氏不完全佐剂，得到第二乳化液，将所述第二乳化液再次注入所述试验动物体内，持续2～
10
天进行增强免疫；所述首次免疫到所述增强免疫的时间间隔为2～6周，例如4周，并重复3～6次所述增强免疫，例如4，5次，相邻两次所述增强免疫的时间间隔为2～6周，例如4周；取得所述试验动物体内的免疫脾细胞，取骨髓瘤细胞，将所述免疫脾细胞和所述骨髓瘤细胞融合，得到融合细胞，进行培养，得到培养液；以所述英夫利西
(Fab)2
片段为抗原，以所述培养液的上清液为抗体来源，采用酶联免疫吸附测定方法筛选出抗英夫利本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种英夫利西的检测试剂的制备方法，其特征在于，包括：制备英夫利西（
Fab
）2片段作为抗原；使用所述抗原引发免疫反应，筛选得到能与所述抗原结合的捕获抗体和检测抗体；取所述捕获抗体和链霉亲和素磁珠反应得到磁微粒工作液；取所述检测抗体和催化酶偶联反应得到酶标工作液；所述磁微粒工作液
、
所述酶标工作液和发光指示剂作为所述英夫利西的检测试剂；所述催化酶能催化所述发光指示剂发光
。2.
根据权利要求1所述的英夫利西的检测试剂的制备方法，其特征在于，所述制备英夫利西（
Fab
）2片段，包括：将英夫利西溶解，加入（
Fab
）2特异性剪切酶，孵育，去除未反应的英夫利西，去除从英夫利西切割下的
Fc
段以及去除所述（
Fab
）2特异性剪切酶，收集含有英夫利西（
Fab
）2片段的剩余物；所述（
Fab
）2特异性剪切酶为
IdeZ
蛋白酶
、IdeS
蛋白酶或胃蛋白酶
。3.
根据权利要求2所述的英夫利西的检测试剂的制备方法，其特征在于：将英夫利西和（
Fab
）2特异性剪切酶孵育后的液体先通过抗体纯化柱，来去除未反应的英夫利西和去除从英夫利西中切割下的
Fc
片段，再通过
Ni
亲和层析柱，来去除所述（
Fab
）2特异性剪切酶
。4.
根据权利要求1所述的英夫利西的检测试剂的制备方法，其特征在于，筛选得到所述捕获抗体和所述检测抗体，包括：取英夫利西（
Fab
）2片段，加入弗氏完全佐剂，得到第一乳化液，将所述第一乳化液注入试验动物体内进行首次免疫；继续取英夫利西（
Fab
）2片段，加入弗氏不完全佐剂，得到第二乳化液，将所述第二乳化液再次注入所述试验动物体内，持续
2~10
天进行增强免疫；所述首次免疫到所述增强免疫的时间间隔为
2~6
周，并重复
3~6
次所述增强免疫，相邻两次所述增强免疫的时间间隔为
2~6
周；取得所述试验动物体内的免疫脾细胞，取骨髓瘤细胞，将所述免疫脾细胞和所述骨髓瘤细胞融合，得到融合细胞，进行培养，得到培养液；以所述英夫利西（
Fab
）2片段为抗原，以所述培养液的上清液为抗体来源，采用酶联免疫吸附测定方法筛选出抗英夫利西的所述捕获抗体和所述检测抗体
。5.
根据权利要求4所述的英夫利西的检测试剂的制备方法，其特征在于，采用酶联免疫吸附测定方法筛选出抗英夫利西的所述捕获抗体和所述检测抗体，包括：先对所述培养液的上清液进行效价测定，对效价检测阳性的克隆再进行竞争性筛选，竞争性筛选采用所述英夫利西（
Fab
）2片段包被基体，再加入肿瘤坏死因子
TNF
‑
α
，以及所述培养液的上清液；选取细胞效价测定强阳性，同时竞争性筛选弱阳性或阴性的克隆，筛选到多个竞争性抗英夫利西独特型抗体；将每个所述抗英夫利西独特型抗体和辣根过氧化物酶
HRP
偶联，得到多个偶联试剂；将每个所述抗英夫利西独特型抗体包被基体，再加入英夫利西，反应后清洗基体，再加入任意一种所述偶联试剂，接着加入四甲基联苯胺
TMB

【专利技术属性】
技术研发人员：张望，周裕军，周建平，吴鸣月，王艳新，
申请(专利权)人：北京丹大生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：