用双裂解内切核酸酶靶向致癌突变制造技术

技术编号：39504594 阅读：8 留言：0更新日期：2023-11-24 11:36

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【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用双裂解内切核酸酶靶向致癌突变
[0001]交叉引用
[0002]本申请要求
2021
年3月
26
日提交的美国临时申请系列第
63/166,763
号的权益，该申请通过引用以其整体并入本文
。
[0003]专利技术背景
[0004]癌症是全世界死亡的主要原因之一
。
在
2018
年，全世界存在
1810
万例新的病例以及
950
万例癌症相关死亡
。
到
2040
年，每年新的癌症病例的数目预计上升至
2950
万，并且癌症相关死亡的数目上升至
1640
万
。
原癌基因是具有引起癌症的潜能的基因
。
在突变后，原癌基因变成了癌基因
。
在肿瘤细胞中，原癌基因通常突变，或以高水平表达，并且可能导致不受控制的细胞生长，这是癌症的标志
。
许多目前的疗法靶向由癌基因表达的突变的蛋白，但是不存在靶向癌基因本身的疗法
。
因此，开发新技术来破坏癌基因是重要的
。
[0005]专利技术概述
[0006]本文描述了嵌合核酸酶，所述嵌合核酸酶包含
I
‑
TevI
结构域
(1)、Cas
结构域和使嵌合核酸酶靶向致癌突变的引导
RNA。
这样的嵌合核酸酶有利地允许精确靶向并编辑细胞基因组，...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.
一种组合物，包含：嵌合核酸酶，其中所述嵌合核酸酶包含
I
‑
TEVI
核酸酶结构域
、RNA
引导的核酸酶
Cas
结构域和引导
RNA
，其中所述引导
RNA
包含靶向致癌突变的核酸序列，所述致癌突变不是
EGFR
外显子
19
中的缺失
。2.
一种组合物，包含：嵌合核酸酶，其中所述嵌合核酸酶包含
I
‑
TEVI
核酸酶结构域
、RNA
引导的核酸酶
Cas
结构域和引导
RNA
，其中所述引导
RNA
包含靶向致癌突变的核酸序列，其中所述致癌突变是
(i)
一个或更多个核苷酸的插入，或
(ii)10
个或更少核苷酸的取代或缺失
。3.
根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述致癌突变是单核苷酸多态性
。4.
根据权利要求1‑3所述的组合物，其中包含所述致癌突变的序列选自
SEQ ID NO:1
‑
683
中的任一种中列出的突变或其组合
。5.
根据权利要求1‑3中任一项所述的组合物，其中包含所述致癌突变的序列与
SEQ ID NO:1
‑
683
中的任一种中列出的突变或其组合至少
85
％
、90
％
、95
％
、97
％
、98
％或
99
％相同
。6.
根据权利要求1‑5中任一项所述的组合物，其中所述致癌突变包括对应于
EGFR L858R
突变或
EGFR V769_D770insASV
突变的突变
。7.
根据权利要求1‑6中任一项所述的组合物，其中所述致癌突变包括对应于
EGFR L858R
突变的突变
。8.
根据权利要求1‑7中任一项所述的组合物，其中所述引导
RNA
与
SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:130
或
SEQ ID NO:141
中列出的靶核苷酸序列杂交，或者包含
SEQ ID NO:1045、SEQ ID NO:1130、SEQ ID NO:1141
或
SEQ ID NO:1686
中列出的核苷酸序列
。9.
根据权利要求1‑7中任一项所述的组合物，其中所述引导
RNA
包含杂交至与
SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:141
中任一种至少
85
％
、90
％
、95
％
、97
％
、98
％或
99
％相同的靶核酸序列的核酸序列，或者包含与
SEQ ID NO:1045、SEQ ID NO:1130、SEQ ID NO:1141
或
SEQ ID NO:1686
中任一种至少
85
％
、90
％
、95
％
、97
％
、98
％或
99
％相同的核苷酸序列
。10.
根据权利要求1‑9中任一项所述的组合物，其中所述致癌突变包括对应于
EGFR V769_D770insASV
突变的突变
。11.
根据权利要求1‑
10
中任一项所述的组合物，其中所述引导
RNA
与
SEQ ID NO:683
中列出的靶核苷酸序列杂交，或者包含
SEQ ID NO:1683
或
SEQ ID NO:1684
中列出的核苷酸序列
。12.
根据权利要求1‑
10
中任一项所述的组合物，其中所述引导
RNA
包含杂交至与
SEQ ID NO:683
中任一种至少
85
％
、90
％
、95
％
、97
％
、98
％或
99
％相同的靶核酸序列的核酸序列，或者包含与
SEQ ID NO:1683
或
SEQ ID NO:1684
中任一种至少
85
％
、90
％
、95
％
、97
％
、98
％或
99
％相同的核苷酸序列
。13.
根据权利要求1‑
12
中任一项所述的组合物，其中所述致癌突变是选自
Muc4、PIK3CA、KRAS
中任一个的基因的致癌突变或其组合
。14.
根据权利要求1‑
13
中任一项所述的组合物，其中所述致癌突变包括
Muc4
突变
。15.
根据权利要求
14
所述的组合物，其中所述
Muc4
突变是外显子2的框内缺失或外显子3的框内缺失
。16.
根据权利要求
14
或
15
所述的组合物，其中所述
Muc4
突变包括对应于人类
Muc4
蛋白的位置
P1542、P1680、T1711、V1721、P1826、A1830、S3560、A1833、D2253、V2281、P3088、
T3119、T3183、V3817、A3902
中任一个的突变或其组合
。17.
根据权利要求
14
‑
16
中任一项所述的组合物，其中所述
Muc4
突变选自对应于人类
Muc4
蛋白的
P1542L、P1680S、T1711I、V1721A、P1826H、A1830T、S3560S、A1833V、D2253H、V2281AM、P3088L、T3119T、T3183M、V3817A、A3902V
中任一个的突变或其组合
。18.
根据权利要求1‑
17
中任一项所述的组合物，其中所述引导
RNA
与
SEQ ID NO:676、SEQ ID NO:677、SEQ ID NO:678、SEQ ID NO:679
或
SEQ ID NO:682
中列出的靶核苷酸序列杂交，或者包含
SEQ ID NO:1676、SEQ ID NO:1677、SEQ ID NO:1678、SEQ ID NO:1679、SEQ ID NO:1682
或
SEQ ID NO:1685
中列出的核苷酸序列
。19.
根据权利要求1‑
17
中任一项所述的组合物，其中所述引导
RNA
包含杂交至与
SEQ ID NO:676、SEQ ID NO:677、SEQ ID NO:678、SEQ ID NO:679
或
SEQ ID NO:682
中任一种至少
85
％
、90
％
、95
％
、97
％
、98
％或
99
％相同的靶核酸序列的核酸序列，或者包含与
SEQ ID NO:1676、SEQ ID NO:1677、SEQ ID NO:1678、SEQ ID NO:1679、SEQ ID NO:1682
或
SEQ ID NO:1685
中任一种至少
85
％
、90
％
、95
％
、97
％
、98
％或
99
％相同的核苷酸序列
。20.
根据权利要求1‑
19
中任一项所述的组合物，其中所述致癌突变包括
PIK3CA
突变
。21.
根据权利要求
20
所述的组合物，其中所述
PIK3CA
突变包括对应于人类
PIK3A
蛋白的位置
H1047、E542、E545、N345、C1636、G1624、G1633、A3140、C3075、A1634、A1173
中任一个的突变或其组合
。22.
根据权利要求
20
或
21
所述的组合物，其中所述
PIK3CA
突变选自对应于人类
PIK3A
蛋白的
H1047R、H1047L、E542K、E545K、N345K、C1636A、G1624A、G1633A、A3140T、A3140G、C3075T、A1634C、A1173G
中任一个的突变或其组合
。23.
根据权利要求1‑
22
中任一项所述的组合物，其中所述引导
RNA
与
SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:202、SEQ ID NO:204、SEQ ID NO:209
或
SEQ ID NO:210
中列出的靶核苷酸序列杂交，或者包含
SEQ ID NO:1005、SEQ ID NO:1006、SEQ ID NO:1007、SEQ ID NO:1008、SEQ ID NO:1033、SEQ ID NO:1202、SEQ ID NO:1204、SEQ ID NO:1209
或
SEQ ID NO:1210
中列出的核苷酸序列
。24.
根据权利要求1‑
22
中任一项所述的组合物，其中所述引导
RNA
包含杂交至与
SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:202、SEQ ID NO:204、SEQ ID NO:209
或
SEQ ID NO:210
中任一种至少
85
％
、90
％
、95
％
、97
％
、98
％或
99
％相同的靶核酸序列的核酸序列，或者包含与
SEQ ID NO:1005、SEQ ID NO:1006、SEQ ID NO:1007、SEQ ID NO:1008、SEQ ID NO:1033、SEQ ID NO:1202、SEQ ID NO:1204、SEQ ID NO:1209
或
SEQ ID NO:1210
中任一种至少
85
％
、90
％
、95
％
、97
％
、98
％或
99
％相同的核苷酸序列
。25.
根据权利要求1‑
24
中任一项所述的组合物，其中所述致癌突变包括
KRAS
突变
。26.
根据权利要求
25
所述的组合物，其中所述
KRAS
突变包括选自对应于人类
KRAS
蛋白的位置
A59、D119、D33、G21、G12、G13、Q61、A146、K117
中任一个的突变或其组合的突变
。27.
根据权利要求
25
或
26
所述的组合物，其中所述
KRAS
突变选自对应于人类
KRAS
蛋白的
A59T、A59E、A59T、D119N、D33E、G21C、G12C、G12D、G12V、G12R、G12A、G12S、G13D、G13C、G13V、G13R、Q61R、Q61V、Q61L、Q61K、Q61H、Q61A、Q61P、Q61E、A146T、A146V、K117N、K117R
中任一个的突变或其组合
。
28.
根据权利要求1‑
27
中任一项所述的组合物，其中所述引导
RNA
与
SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63
或
SEQ ID NO:77
中列出的靶核苷酸序列杂交，或者包含
SEQ ID NO:1037、SEQ ID NO:1042、SEQ ID NO:1051、SEQ ID NO:1052、SEQ ID NO:1062、SEQ ID NO:1063
或
SEQ ID NO:1077
中列出的核苷酸序列
。29.
根据权利要求1‑
27
中任一项所述的组合物，其中所述引导
RNA
包含杂交至与
SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63
或
SEQ ID NO:77
中任一种至少
85
％
、90
％
、95
％
、97
％
、98
％或
99
％相同的靶核酸序列的核酸序列，或者包含与
SEQ ID NO:1037、SEQ ID NO:1042、SEQ ID NO:1051、SEQ ID NO:1052、SEQ ID NO:1062、SEQ ID NO:1063
或
SEQ ID NO:1077
中任一种至少
85
％
、90
％
、95
％
、97
％
、98
％或
99
％相同的核苷酸序列
。30.
根据权利要求1至
29
中任一项所述的组合物，其中所述引导
RNA
包含以下的一种或更多种：非天然核苷间键
、
核酸模拟物
、
修饰的糖部分或修饰的核碱基
。31.
根据权利要求
30
所述的组合物，其中所述非天然核苷间键包括以下的一种或更多种：硫代磷酸酯
、
磷酰胺酯
、
非磷酸二酯
、
杂原子
、
手性硫代磷酸酯
、
二硫代磷酸酯
、
磷酸三酯
、
氨基烷基磷酸三酯
、3
’‑
亚烷基膦酸酯
、5
’‑
亚烷基膦酸酯
、
手性膦酸酯
、
次膦酸酯
、3
’‑
氨基磷酰胺酯
、
氨基烷基磷酰胺酯
、
磷酸二胺酯
、
硫羰基磷酰胺酯
、
硫羰基烷基膦酸酯
、
硫羰基烷基磷酸三酯
、
硒磷酸酯或硼烷磷酸酯
。32.
根据权利要求
30
或
31
所述的组合物，其中所述核酸模拟物包括肽核酸
(PNA)、
吗啉代核酸
、
环己烯基核酸
(CeNA)
或锁核酸
(LNA)
中的一种或更多种
。33.
根据权利要求
30
‑
32
中任一项所述的组合物，其中所述修饰的糖部分包括2′‑
O
‑
(2
‑
甲氧基乙基
)、2
′‑
二甲基氨基氧基乙氧基
、2
′‑
二甲基氨基乙氧基乙氧基
、2
′‑
O
‑
甲基或2′‑
氟中的一种或更多种
。34.
根据权利要求
30
‑
33
中任一项所述的组合物，其中所述修饰的核碱基包括以下的一种或更多种：5‑
甲基胞嘧啶；5‑
羟甲基胞嘧啶；黄嘌呤；次黄嘌呤；2‑
氨基腺嘌呤；腺嘌呤的6‑
甲基衍生物；鸟嘌呤的6‑
甲基衍生物；腺嘌呤的2‑
丙基衍生物；鸟嘌呤的2‑
丙基衍生物；2‑
硫代尿嘧啶；2‑
硫代胸腺嘧啶；2‑
硫代胞嘧啶；5‑
卤尿嘧啶；5‑
卤胞嘧啶；5‑
丙炔基尿嘧啶；5‑
丙炔基胞嘧啶；6‑
偶氮尿嘧啶；6‑
偶氮胞嘧啶；6‑
偶氮胸腺嘧啶；假尿嘧啶；4‑
硫尿嘧啶；8‑
卤素；8‑
氨基；8‑
硫醇；8‑
硫代烷基；8‑
羟基；5‑
卤素；5‑
溴；5‑
三氟甲基；5‑
取代的尿嘧啶；5‑
取代的胞嘧啶；7‑
甲基鸟嘌呤；7‑
甲基腺嘌呤；2‑
F
‑
腺嘌呤；2‑
氨基腺嘌呤；8‑
氮杂鸟嘌呤；8‑
氮杂腺嘌呤；7‑
去氮鸟嘌呤；7‑
去氮腺嘌呤；3‑
去氮鸟嘌呤；3‑
去氮腺嘌呤；三环嘧啶；苯噁嗪胞苷；吩噻嗪胞苷；取代的苯噁嗪胞苷；咔唑胞苷；吡啶吲哚胞苷；7‑
去氮腺嘌呤；7‑
去氮鸟苷；2‑
氨基吡啶；2‑
吡啶酮；5‑
取代的嘧啶；6‑
氮杂嘧啶；
N
‑
2、N
‑6或
O
‑6取代的嘌呤；2‑
氨基丙基腺嘌呤；5‑
丙炔基尿嘧啶；或5‑
丙炔基胞嘧啶
。35.
根据权利要求1‑
34
中任一项所述的组合物，所述组合物还包含可操作地连接至所述
I
‑
TEVI
核酸酶结构域和所述
RNA
引导的核酸酶
Cas
结构域的接头
。36.
根据权利要求
35
所述的组合物，其中所述接头包含
SEQ ID NO:701、SEQ ID NO:702、SEQ ID NO:703
或
SEQ ID NO:704
中列出的氨基酸序列
。37.
根据权利要求
35
或
36
所述的组合物，其中所述接头包含对应于位置
T95、S101、
A119、K120、K135、P126、D127、N140、T147、Q158、A161、V117、S165
中任一个的突变或其组合
。38.
根据权利要求
35
‑
37
中任一项所述的组合物，其中所述接头包含选自对应于
T95S、S101Y、A119D、K120N、K135N、K135R、P126S、D127K、N140S、T147I、Q158R、A161V、V117F、S165G
中任一个的突变或其组合的突变
。39.
根据权利要求
35
所述的组合物，其中所述接头包含与
SEQ ID NO:701、SEQ ID NO:702、SEQ ID NO:703
或
SEQ ID NO:704
至少
85
％
、90
％
、95
％
、97
％
、98
％或
99
％相同的氨基酸序列
。40.
根据权利要求
35
或
39
所述的组合物，其中所述接头包含对应于位置
T95、S101、A119、K120、K135、P126、D127、N140、T147、Q158、A161、V117、S165
中任一个的突变或其组合
。41.
根据权利要求
35、39
或
40
中任一项所述的组合物，其中所述接头包含选自对应于
T95S、S101Y、A119D、K120N、K135N、K135R、P126S、D127K、N140S、T147I、Q158R、A161V、V117F、S165G
中任一个的突变或其组合的突变
。42.
根据权利要求1‑
41
中任一项所述的组合物，其中所述
RNA
引导的核酸酶
Cas
结构域是
RNA
引导的核酸酶
Cas9
结构域
。43.
根据权利要求
42
所述的组合物，其中所述
RNA
引导的核酸酶
Cas9
结构域是以下的任一种：
RNA
引导的核酸酶金黄色葡萄球菌
(Staphylococcus aureus)Cas9
结构域
、RNA
引导的核酸酶酿脓链球菌
(Streptococcus pyogenes)Cas9
结构域
、RNA
引导的核酸酶脑膜炎奈瑟菌
(Neisseria meningitidis)Cas9
结构域
、RNA
引导的核酸酶空肠弯曲菌
(Campylobacter jejuni)Cas9
结构域
、RNA
引导的核酸酶巴氏链球菌
(Streptococcus pasteurianus)Cas9
结构域
、RNA
引导的核酸酶巴氏链球菌
Cas9
结构域
、RNA
引导的核酸酶解纤维素梭菌
(Clostridiumcellulolyticum)Cas9
结构域
、RNA
引导的核酸酶热脱氮地芽孢杆菌
(Geobacillus thermodenitrificans)T1 Cas9
结构域或其组合
。44.
根据权利要求
42
或
43
所述的组合物，其中所述
RNA
引导的核酸酶
Cas9
结构域是
RNA
引导的核酸酶金黄色葡萄球菌
Cas9
结构域
。45.
根据权利要求
42
‑
44
中任一项所述的组合物，其中所述
RNA
引导的核酸酶金黄色葡萄球菌
Cas9
结构域包含
SEQ ID NO:710
中列出的氨基酸序列
。46.
根据权利要求
42
‑
45
中任一项所述的组合物，其中所述
RNA
引导的核酸酶金黄色葡萄球菌
Cas9
结构域包含对应于以下位置的任一个的突变或其组合：
D10、H557、N580、H840、D1135、R1335、T1337、T267、L325、V327、D333、A336、I341、E345、D348、K352、S360、T368、N369、N371、S372、E373、K386、N393、H408、N410、I414、A415、T438、Y467、N471、D485、M489、E506、R409、T510、N515、Y518、A539、F550、N551、S596、T602、A611、I617、T620、G654、N667、R685、K695、I706、K722、A723、K724、M731、F732、K735、S739、P741、E742、E746、Q747、I754、T755、H757、K760、H761、P778、E781、I783、N784、D785、T786L、L787、Y788、K792、D794、T798、L799、V801、N803、L804、N805、G806、D813、K814、L818、I819、S822、E824、L841、G847、D848、Y857、V875、I876、N884、A888、L890、D894、D895、P897、V903、G920、F924、N929、E936、N937、V941、N942、S943、C945、E947、K951、L952、S956、N957、Q958、A959、N974、G975、V983、N984、N985、D986、I991、V993、M995、I996、T999、Y1000、R1001、E1002、L1004、E1005、N1006、M1007、D1009、K1010、R1011、P1012、P1013、I1015、I1016、A1020、S1021、Q1024、K1027、E1039、H1045、I0148、K1050。
47.
根据权利要求
42
‑
46
中任一项所述的组合物，其中所述
RNA
引导的核酸酶金黄色葡萄球菌
Cas9
结构域包含选自对应于以下的任一个的突变或其组合的突变：
D10A、D10E、H557A、N580A、H840A、D1135E、R1335Q、T1337R、T267A、L325F、V327I、D333G、A336S、I341L、E345D、D348N、K352E、S360A、T368A、N369E、N371E、S372P、E373K、K386T、N393R、H408N、N410S、I414M、A415T、T438S、Y467F、N471K、D485E、M489F、E506K、R409K、T510E、N515K、Y518F、A539P、F550Y、N551H、S596A、T602I、A611S、I617V、T620K、G654E、N667D、R685K、K695Q、I706V、K722T、A723T、K724N、M731T、F732V、K735Q、S739N、P741L、E742G、E746D、Q747D、I754D、T755I、H757R、K760Q、H761S、P778I、E781K、I783V、N784D、D785E、T786L、L787V、Y788H、K792E、D794T、T798R、L799I、V801I、N803S、L804I、N805K、G806N、D813G、K814E、L818I、I819F、S822P、E824G、L841T、G847S、D848N、Y857H、V875I、I876V、N884K、A888V、L890R、D894G、D895H、P897L、V903I、G920D、F924L、N929Y、E936D、N937G、V941I、N942D、S943L、C945A、E947K、K951R、L952Q、S956N、N957E、Q958K、A959S、N974D、G975K、V983A、N984S、N985D、D986G、I991V、V993L、M995F、I996V、T999N、Y1000K、R1001E、E1002D、L1004I、E1005K、N1006M、M1007N、D1009L、K1010S、R1011T、P1012S、P1013F、I1015L、I1016R、A1020G、S1021K、Q1024K、K1027S、E1039K、H1045K、I0148M、K1050M。48.
根据权利要求
42
‑
44
中任一项所述的组合物，其中所述
RNA
引导的核酸酶金黄色葡萄球菌
Cas9
结构域包含与
SEQ ID NO:710
至少
85
％
、90
％
、95
％
、97
％
、98
％或
99
％相同的氨基酸序列
。49.
根据权利要求
42
‑
44
或
48
中任一项所述的组合物，其中所述
RNA
引导的核酸酶金黄色葡萄球菌
Cas9
结构域包含对应于以下位置的任一个的突变或其组合：
D10、H557、N580、H840、D1135、R1335、T1337、T267、L325、V327、D333、A336、I341、E345、D348、K352、S360、T368、N369、N371、S372、E373、K386、N393、H408、N410、I414、A415、T438、Y467、N471、D485、M489、E506、R409、T510、N515、Y518、A539、F550、N551、S596、T602、A611、I617、T620、G654、N667、R685、K695、I706、K722、A723、K724、M731、F732、K735、S739、P741、E742、E746、Q747、I754、T755、H757、K760、H761、P778、E781、I783、N784、D785、T786L、L787、Y788、K792、D794、T798、L799、V801、N803、L804、N805、G806、D813、K814、L818、I819、S822、E824、L841、G847、D848、Y857、V875、I876、N884、A888、L890、D894、D895、P897、V903、G920、F924、N929、E936、N937、V941、N942、S943、C945、E947、K951、L952、S956、N957、Q958、A959、N974、G975、V983、N984、N985、D986、I991、V993、M995、I996、T999、Y1000、R1001、E1002、L1004、E1005、N1006、M1007、D1009、K1010、R1011、P1012、P1013、I1015、I1016、A1020、S1021、Q1024、K1027、E1039、H1045、I0148、K1050。50.
根据权利要求
42
‑
44、48
或
49
中任一项所述的组合物，其中所述
RNA
引导的核酸酶金黄色葡萄球菌
Cas9
结构域包含选自对应于以下的任一个的突变或其组合的突变：
D10A、D10E、H557A、N580A、H840A、D1135E、R1335Q、T1337R、T267A、L325F、V327I、D333G、A336S、I341L、E345D、D348N、K352E、S360A、T368A、N369E、N371E、S372P、E373K、K386T、N393R、H408N、N410S、I414M、A415T、T438S、Y467F、N471K、D485E、M489F、E506K、R409K、T510E、N515K、Y518F、A539P、F550Y、N551H、S596A、T602I、A611S、I617V、T620K、G654E、N667D、R685K、K695Q、I706V、K722T、A723T、K724N、M731T、F732V、K735Q、S739N、P741L、E742G、E746D、Q747D、I754D、T755I、H757R、K760Q、H761S、P778I、E781K、I783V、N784D、D785E、
T786L、L787V、Y788H、K792E、D794T、T798R、L799I、V801I、N803S、L804I、N805K、G806N、D813G、K814E、L818I、I819F、S822P、E824G、L841T、G847S、D848N、Y857H、V875I、I876V、N884K、A888V、L890R、D894G、D895H、P897L、V903I、G920D、F924L、N929Y、E936D、N937G、V941I、N942D、S943L、C945A、E947K、K951R、L952Q、S956N、N957E、Q958K、A959S、N974D、G975K、V983A、N984S、N985D、D986G、I991V、V993L、M995F、I996V、T999N、Y1000K、R1001E、E1002D、L1004I、E1005K、N1006M、M1007N、D1009L、K1010S、R1011T、P1012S、P1013F、I1015L、I1016R、A1020G、S1021K、Q1024K、K1027S、E1039K、H1045K、I0148M、K1050M。51.
根据权利要求
42
‑
50
中任一项所述的组合物，其中所述
RNA
引导的核酸酶金黄色葡萄球菌
Cas9
结构域包含对应于
D10E
突变的突变
。52.
根据权利要求
42
或
43
所述的组合物，其中所述
RNA
引导的核酸酶
Cas9
结构域是
RNA
引导的核酸酶酿脓链球菌
Cas9
结构域
。53.
根据权利要求
42、43
或
52
中任一项所述的组合物，其中所述
RNA
引导的核酸酶酿脓链球菌
Cas9
结构域包含
SEQ ID NO:711
中列出的氨基酸序列
。54.
根据权利要求
42、43、52
或
53
中任一项所述的组合物，其中所述
RNA
引导的核酸酶酿脓链球菌
Cas9
结构域包含对应于以下位置的任一个的突变或其组合：
D10、S29、F32、D39、R40、H41、S42、I48、C80、S87、K112、H113、K132、K141、D147、L158、E171、P176、I186、V189、Q190、Q194、N199、I201、N202、A203、S204、R205、A210、Q228、L229、G231、S245、T249、S254、D261、T270、N295、T300、D304、V308、N309、I312、T333、A337、E345、F352、Q354、S355、K356、G366、A367、E396、L398、I414、D428、F429、D435、K468、S469、E470、T472、E480、A486、S490、F498、K500、N501、N504、K528、V530、E532、G533、A538、T555、K570、F575、D605、E611、R629、E634、T638、R655、R664、R671、K705、E706、Q709、K710、S714、G7115、G717、H721、H723、A725、N726、V743、L747、V748、K772、K775、N776、I788、G792、K797、Y799、T804、N808、L811、R820、N831、R832、V842、L847、N869、E874、N881、Q885、N888、T893、L911、Y945、D946、L949、E952、A1023、Y1036、G1067、G1077、R1078、N1093、R1114、N1115、D1117、A1121、D1125、P1128、K1129、V1146、S1154、S1159、L1164、S1172、N1177、P1178、I1179、D1180、K1211、M1213、G1218、N1234、E1243、K1244、E1253、E1260、K1263、H1264、E1271、Q1272、E1275、V1290、L1291、S1292、A1293、N1295、H1297、R1298、D1299、K1300、R1303、E1307、N1308、I1309、I1310、H1311、L1312、L1315、T1316、N1317、Y1326、D1328、V1342、A1345、I1360、S1363。55.
根据权利要求
42、43
或
52
‑
54
中任一项所述的组合物，其中所述
RNA
引导的核酸酶酿脓链球菌
Cas9
结构域包含选自对应于以下的任一个的突变或其组合的突变：
D10E、D10A、S29T、F32M、D39N、R40K、H41Q、S42T、I48L、C80R、S87A、K112D、H113N、K132N、K141E、D147E、L158V、E171Q、P176S、I186K、V189L、Q190H、Q194E、N199R、I201L、N202E、A203E、S204I、R205K、A210G、Q228A、L229F、G231N、S245A、T249M、S254A、D261N、T270S、N295K、T300I、D304G、V308A、N309D、I312V、T333A、A337V、E345K、F352S、Q354K、S355T、K356T、G366K、A367T、E396D、L398F、I414V、D428A、F429Y、D435E、K468Q、S469R、E470N、T472A、E480D、A486T、S490L、F498V、K500E、N501H、N504T、K528R、V530I、E532D、G533E、A538E、T555A、K570Q、F575C、D605E、E611D、R629K、E634K、T638K、R655H、R664K、R671K、K705V、E706D、Q709K、K710A、S714F、G7115E、G717K、H721K、H723Q、A725S、N726A、V743I、L747I、V748I、K772Q、K775R、N776R、I788M、G792R、K797E、Y799H、T804A、N808D、L811R、R820K、N831D、
R832H、V842I、L847I、N869D、E874A、N881S、Q885R、N888K、T893S、L911A、Y945H、D946G、L949P、E952A、A1023G、Y1036R、G1067E、G1077E、R1078K、N1093T、R1114G、N1115E、D1117A、A1121P、D1125G、P1128T、K1129T、V1146I、S1154T、S1159P、L1164V、S1172N、N1177D、P1178S、I1179V、D1180S、K1211R、M1213L、G1218T、N1234H、E1243D、K1244T、E1253K、E1260D、K1263Q、H1264Y、E1271D、Q1272W、E1275H、V1290L、L1291R、S1292A、A1293T、N1295E、H1297N、R1298T、D1299H、K1300L、R1303S、E1307D、N1308S、I1309M、I1310L、H1311N、L1312A、L1315F、T1316S、N1317R、Y1326F、D1328N、V1342I、A1345S、I1360L、S1363N。56.
根据权利要求
42、43
或
52
中任一项所述的组合物，其中所述
RNA
引导的核酸酶酿脓链球菌
Cas9
结构域包含与
SEQ ID NO:711
至少
85
％
、90
％
、95
％
、97
％
、98
％或
99
％相同的氨基酸序列
。57.
根据权利要求
42、43、52
或
56
中任一项所述的组合物，其中所述
RNA
引导的核酸酶酿脓链球菌
Cas9
结构域包含对应于以下位置的任一个的突变或其组合：
D10、S29、F32、D39、R40、H41、S42、I48、C80、S87、K112、H113、K132、K141、D147、L158、E171、P176、I186、V189、Q190、Q194、N199、I201、N202、A203、S204、R205、A210、Q228、L229、G231、S245、T249、S254、D261、T270、N295、T300、D304、V308、N309、I312、T333、A337、E345、F352、Q354、S355、K356、G366、A367、E396、L398、I414、D428、F429、D435、K468、S469、E470、T472、E480、A486、S490、F498、K500、N501、N504、K528、V530、E532、G533、A538、T555、K570、F575、D605、E611、R629、E634、T638、R655、R664、R671、K705、E706、Q709、K710、S714、G7115、G717、H721、H723、A725、N726、V743、L747、V748、K772、K775、N776、I788、G792、K797、Y799、T804、N808、L811、R820、N831、R832、V842、L847、N869、E874、N881、Q885、N888、T893、L911、Y945、D946、L949、E952、A1023、Y1036、G1067、G1077、R1078、N1093、R1114、N1115、D1117、A1121、D1125、P1128、K1129、V1146、S1154、S1159、L1164、S1172、N1177、P1178、I1179、D1180、K1211、M1213、G1218、N1234、E1243、K1244、E1253、E1260、K1263、H1264、E1271、Q1272、E1275、V1290、L1291、S1292、A1293、N1295、H1297、R1298、D1299、K1300、R1303、E1307、N1308、I1309、I1310、H1311、L1312、L1315、T1316、N1317、Y1326、D1328、V1342、A1345、I1360、S1363。58.
根据权利要求
42、43、52、56
或
57
中任一项所述的组合物，其中所述
RNA
引导的核酸酶酿脓链球菌
Cas9
结构域包含选自对应于以下的任一个的突变或其组合的突变：
D10E、D10A、S29T、F32M、D39N、R40K、H41Q、S42T、I48L、C80R、S87A、K112D、H113N、K132N、K141E、D147E、L158V、E171Q、P176S、I186K、V189L、Q190H、Q194E、N199R、I201L、N202E、A203E、S204I、R205K、A210G、Q228A、L229F、G231N、S245A、T249M、S254A、D261N、T270S、N295K、T300I、D304G、V308A、N309D、I312V、T333A、A337V、E345K、F352S、Q354K、S355T、K356T、G366K、A367T、E396D、L398F、I414V、D428A、F429Y、D435E、K468Q、S469R、E470N、T472A、E480D、A486T、S490L、F498V、K500E、N501H、N504T、K528R、V530I、E532D、G533E、A538E、T555A、K570Q、F575C、D605E、E611D、R629K、E634K、T638K、R655H、R664K、R671K、K705V、E706D、Q709K、K710A、S714F、G7115E、G717K、H721K、H723Q、A725S、N726A、V743I、L747I、V748I、K772Q、K775R、N776R、I788M、G792R、K797E、Y799H、T804A、N808D、L811R、R820K、N831D、R832H、V842I、L847I、N869D、E874A、N881S、Q885R、N888K、T893S、L911A、Y945H、D946G、L949P、E952A、A1023G、Y1036R、G1067E、G1077E、R1078K、N1093T、R1114G、N1115E、D1117A、A1121P、D1125G、P1128T、K1129T、V1146I、S1154T、S1159P、L1164V、S1172N、N1177D、
P1178S、I1179V、D1180S、K1211R、M1213L、G1218T、N1234H、E1243D、K1244T、E1253K、E1260D、K1263Q、H1264Y、E1271D、Q1272W、E1275H、V1290L、L1291R、S1292A、A1293T、N1295E、H1297N、R1298T、D1299H、K1300L、R1303S、E1307D、N1308S、I1309M、I1310L、H1311N、L1312A、L1315F、T1316S、N1317R、Y1326F、D1328N、V1342I、A1345S、I1360L、S1363N。59.
根据权利要求
42
或
43
所述的组合物，其中所述
RNA
引导的核酸酶
Cas9
结构域是
RNA
引导的核酸酶脑膜炎奈瑟菌
Cas9
结构域
。60.
根据权利要求
42、43
或
59
中任一项所述的组合物，其中所述
RNA
引导的核酸酶脑膜炎奈瑟菌
Cas9
结构域包含
SEQ ID NO:712
中列出的氨基酸序列
。61.
根据权利要求
42、43、59
或
60
中任一项所述的组合物，其中所述
RNA
引导的脑膜炎奈瑟菌核酸酶
Cas9
结构域包含对应于以下位置的任一个的突变或其组合：
I9、D16、D30、E31、A94、I103、P124、N164、I213、G229、T241、S376、E393、G454、K471、G490、D660、C665、K764、T770、P803、A841、H842、K843、D844、L846、R847、K854、H855、N856、K858、K862、W865、E868、I869、A872、D873、N876、Y880、G883、I886、E887、E890、R895、A898、Y899、G900、G901、N902、A903、K904、Q905、D908、N912、K917、G919、L921、V927、K929、T930、E932、S933、L936、L937、N938、K939、K940、Y943、T944、G949、D950、C958、K965、N966、Q967、F969、A975、E980、N981、I986、D987、C988、K989、G990、Y991、R992、I993、D994、Y997、T998、C1000、S1002、H1004、K1005、Y1006、A1010、F1011、Q1012、K1013、D1014、E1015、K1018、V1019、E1020、F1021、A1022、Y1024、I1025、N1026、C1027、D1028、S1029、S1030、N1031、R1033、F1034、Y1035、L1036、A1037、W1038、K1041、G1042、K1044、E1045、Q1046、Q1047、F1048、R1049、I1050、S1051、T1052、Q1053、N1054、L1055、V1056、L1057、I1058、Y1061、V1063、N1064。62.
根据权利要求
42、43
或
59
‑
61
中任一项所述的组合物，其中所述
RNA
引导的核酸酶脑膜炎奈瑟菌
Cas9
结构域包含选自对应于以下的任一个突变或其组合的突变：
I9M、D16E、D30E、E31K、A94D、I103V、P124C、N164D、I213N、G229D、T241A、S376T、E393K、G454C、K471E、G490C、D660E、C665R、K764E、T770A、P803S、A841Q、H842G、K843H、D844E、L846V、R847K、K854R、H855L、N856D、K858G、K862L、W865P、E868Q、I869L、A872K、D873G、N876K、Y880R、G883E、I886P、E887K、E890E、R895Q、A898T、Y899H、G900K、G901D、N902D、A903P、K904T、Q905K、D908A、N912E、K917Y、G919T、L921Q、V927I、K929Q、T930V、E932K、S933T、L936W、L937V、N938R、K939N、K940H、Y943N、T944G、G949A、D950T、C958E、K965G、N966G、Q967K、F969Y、A975S、E980K、N981G、I986R、D987A、C988V、K989V、G990A、Y991F、R992K、I993D、D994E、Y997F、T998E、C1000R、S1002I、H1004Y、K1005A、Y1006N、A1010K、F1011L、Q1012T、K1013A、D1014K、E1015K、K1018N、V1019E、E1020F、F1021L、A1022G、Y1024F、I1025V、N1026S、C1027L、D10...

【专利技术属性】
技术研发人员：布伦特，
申请(专利权)人：特定生物制品公司，
类型：发明
国别省市：

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