【技术实现步骤摘要】
Premier v.5.0
设计暹罗炭疽菌的特异性引物
。
[0009]暹罗炭疽菌的特异性
PCR
检测引物,其核苷酸序列如下:
[0010]引物组1:
[0011]FS13
:
5'
‑
CGATTTAATGAACATATTGGTGGT
‑
3'
;
[0012]RS15
:
5'
‑
GGAAGAAAGATCAGACCTAGTTAC
‑
3'
;或者
[0013]引物组2:
[0014]FS13
:
5'
‑
CGATTTAATGAACATATTGGTGGT
‑
3'
;
[0015]RS13
:
5'
‑
GATGCGCAGTCGTGACAGCGGCTGT
‑
3'
;或者
[0016]引物组3:
[0017]FS13
:
5'
‑
CGATTTAATGAACATATTGGTGGT
‑
3'
;
[0018]RS11
:
5'
‑
GGGCGAATGAATAGTCCCCATGA
‑
3'。
[0019]优选引物组
1。
[0020]上述引物在暹罗炭疽菌快速
PCR
检测中的应用r/>。
[0021]所述引物
FS13/RS15、FS13/RS13
和
FS13/RS11
在
PCR
检测中的扩增产物的大小分别为
290bp、260bp
和
187bp。
[0022]所述暹罗炭疽菌为李树炭疽病病原菌菌群中的暹罗炭疽菌
。
[0023]所述应用,为提取李树叶片的
DNA
,用上述引物进行
PCR
检测
。
[0024]所述
PCR
检测中的
PCR
扩增体系为:
Premix Taq 12.5
μ
L
,浓度为
10
μ
mol/L
的上
、
下游引物各1μ
L
,
DNA
模板1μ
L
,最后加灭菌双蒸水至
25
μ
L。
[0025]所述
PCR
检测中的
PCR
扩增程序均为:
95℃5min
;
95℃40s
,
62℃35s
,
72℃40s
,
35
个循环;
72℃
延伸
7min
;
4℃
保存
。
[0026]对暹罗炭疽菌特异性引物的特异性
、
稳定性和灵敏度进行验证:
[0027]为验证引物的特异性和稳定性,对
18
株
18
种不同种类的炭疽菌
(
包含暹罗炭疽菌菌株
GD10
‑
1)
,
45
株
20
种不同属的真菌,
16
株
14
种不同属的细菌以及
45
株暹罗炭疽菌的
DNA
进行
PCR
扩增,结果显示有3对引物
(FS13/RS15、FS13/RS13
和
FS13/RS11)
均能从暹罗炭疽菌的
DNA
中扩增出单一的目的条带,而其余菌株中未扩增出任何条带
。
将暹罗炭疽菌
(GD10
‑
1)
的
DNA
进行按
10
倍浓度进行梯度稀释,得到以下8个浓度梯度:
10ng
·
μ
L
‑1、1ng
·
μ
L
‑1、100pg
·
μ
L
‑1、10pg
·
μ
L
‑1、1pg
·
μ
L
‑1、100fg
·
μ
L
‑1、10fg
·
μ
L
‑1和
1fg
·
μ
L
‑1,用引物
FS13/RS15、FS13/RS13
和
FS13/RS11
分别进行扩增,结果显示上述引物可检测到的
DNA
最低浓度分别为
1pg
·
μ
L
‑1、100pg
·
μ
L
‑1和
10pg
·
μ
L
‑1。
[0028]暹罗炭疽菌
PCR
检测引物的应用:
[0029]为验证3组引物
FS13/RS15、FS13/RS13
和
FS13/RS11
能从接种暹罗炭疽菌
(GD10
‑
1)
后的李树叶片的混合
DNA
中也能准确检测出暹罗炭疽菌的特异条带,用暹罗炭疽菌
(GD10
‑
1)
的孢子悬浮液对本实验室温室种植的2年生的健康李树植株活体叶片进行人工有伤接种
。
将
ddH2O
接种的叶片作为阴性对照
。
接种后,每隔
24h
取一次叶片样品带回实验室提取基因组
DNA
,用引物
FS13/RS15、FS13/RS13
和
FS13/RS11
分别进行
PCR
检测
。
结果显示,3组引物均能从所有接种了暹罗炭疽菌
(GD10
‑
1)
的李树叶片的
DNA
中检测到暹罗炭疽菌的目的条带,而对照组扩增不到任何条带
。
说明上述检测引物可以直接从混合
DNA
样品中检测到暹罗炭疽菌的
DNA。
[0030]为进一步将上述引物应用于田间李树叶片样品的检测,于
2022
年3‑7月,分别在广西河池市天峨县六排镇纳州村李树种植基地和广西河池市天峨县山旮沓实业有限公司李树种植基地这2个基地各随机选定4棵李树,做好标记,随机采样,每次采样8份
。
发现3组引物均可以从李树叶部检测到暹罗炭疽菌的特异本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.
暹罗炭疽菌
(Colletotrichumfructicola)
的特异性
PCR
检测引物,其核苷酸序列如下:引物组1:
FS13
:
5'
‑
CGATTTAATGAACATATTGGTGGT
‑
3'
;
RS15
:
5'
‑
GGAAGAAAGATCAGACCTAGTTAC
‑
3'
;或者引物组2:
FS13
:
5'
‑
CGATTTAATGAACATATTGGTGGT
‑
3'
;
RS13
:
5'
‑
GATGCGCAGTCGTGACAGCGGCTGT
‑
3'
;或者引物组3:
FS13
:
5'
‑
CGATTTAATGAACATATTGGTGGT
‑
3'
;
RS11
:
5'
‑
GGGCGAATGAATAGTCCCCATGA
‑
3'。2.
权利要求1所述的引物,其核苷酸序列如下:引物组1:
FS13
:
5'
‑
CGATTTAATGAACATATTGGTGGT
‑
3'
;
RS15
:
5'
‑
GGAAGAAAGATCAGACCTAGTTAC
‑
3'...
【专利技术属性】
技术研发人员:李其利,鲁萌萌,唐利华,黄穗萍,陈小林,郭堂勋,
申请(专利权)人:广西壮族自治区农业科学院,
类型:发明
国别省市:
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