检测N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶的胶体金试纸及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种检测N

【技术实现步骤摘要】
检测N
‑
乙酰
‑
β
‑
D氨基葡萄糖苷酶的胶体金试纸及其制备方法


[0001]本专利技术涉及N
‑
乙酰
‑
β
‑
D氨基葡萄糖苷酶的检测
，特别涉及检测N
‑
乙酰
‑
β
‑
D氨基葡萄糖苷酶的胶体金试纸条、试纸卡及其应用。

技术介绍

[0002]N
‑
乙酰
‑
β
‑
D
‑
氨基葡萄糖苷酶(N
‑
acetyl
‑
β
‑
D
‑
glucosaminidase,NAG,β
‑2‑
aceta
‑
mido
‑2‑
deoxy
‑
D
‑
glucoside acetamidodeoxyglucohydrolase，EC3.2.1.30)是一种位于溶酶体内的酸性水解酶，简称NAG，其分子量约112500
±
19000，广泛存在于人体各种组织器官、体液及血细胞的溶酶体中，但在前列腺和肾脏近端肾小管中含量最高。当肾近曲小管受损时，尿液中的NAG水平明显升高。因此，NAG是反应肾小管功能的敏感指标。NAG也可作为糖尿病早期肾损伤诊断的标志物。
[0003]目前，常用的N
‑
乙酰
‑
β
‑
D氨基葡萄糖苷酶的测定方法有底物法、酶法、速率法、两点法等。以上方法都是利用N
‑
乙酰
‑
β
‑
D氨基葡萄糖苷酶与底物的酶促反应来测定其活性，反应容易受酶浓度、底物浓度、反应温度以及检测样本的pH、离子强度和可能存在的抑制剂的干扰。

技术实现思路

[0004]针对以上现有技术的不足，本专利技术提供了检测N
‑
乙酰
‑
β
‑
D氨基葡萄糖苷酶的胶体金试纸及其制备方法，具体通过以下技术实现。
[0005]检测N
‑
乙酰
‑
β
‑
D氨基葡萄糖苷酶的胶体金试纸，所述胶体金试纸包括底板，以及设在底板上的样品垫、结合垫、反应垫和吸水垫，所述结合垫上吸附有胶体金标记的NAG抗体Ⅰ或NAG抗体Ⅱ，相应地，所述反应垫的T线上包被有所述NAG抗体Ⅱ或所述NAG抗体Ⅰ；
[0006]所述NAG抗体Ⅰ的重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.1
‑
3所示，轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.4
‑
5所示，轻链可变区的互补决定区CDR2的氨基酸序列为YAS；
[0007]所述NAG抗体Ⅱ的重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.6
‑
8所示，轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.9
‑
10所示，轻链可变区的互补决定区CDR2的氨基酸序列为WAS。
[0008]本专利技术提供的胶体金试纸，是同时使用了两种NAG抗体，即NAG抗体Ⅰ和NAG抗体Ⅱ。需要说明的是，这两种NAG抗体的制备方法是，先在胎盘中提取N
‑
乙酰
‑
β
‑
D
‑
氨基葡萄糖苷酶(NAG蛋白)，再将NAG蛋白用动物免疫，提取B细胞并之辈杂交瘤细胞，最后筛选出能特异性识别NAG蛋白的抗体，送至第三方基因测序公司测序后，获得了NAG抗体Ⅰ和NAG抗体Ⅱ的核苷酸序列。还需要说明的是，在使用这两种抗体时，可以将NAG抗体Ⅰ吸附在结合垫上，将NAG抗体Ⅱ包被在T线上；也可以反过来NAG抗体Ⅱ吸附在结合垫上，将NAG抗体Ⅰ包被在T线上。这两种方式制备的胶体金试纸的检测效果都非常好。
[0009]优选地，所述NAG抗体Ⅰ的重链可变区的骨架区FR1、FR2、FR3、FR4的氨基酸序列如
SEQ ID NO.11
‑
14所示，轻链可变区的骨架区FR1、FR2、FR3、FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.15
‑
18所示；
[0010]所述NAG抗体Ⅱ的重链可变区的骨架区FR1、FR2、FR3、FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.19
‑
22所示，轻链可变区的骨架区FR1、FR2、FR3、FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.23
‑
26所示。
[0011]更优选地，所述NAG抗体Ⅰ、NAG抗体Ⅱ的轻链恒定区均为κ链，重链恒定区均为IgG2a型。
[0012]进一步优选地，所述NAG抗体Ⅰ的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.27所示，轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.28所示；所述NAG抗体Ⅱ的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.29所示，轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.30所示。
[0013]优选地，所述结合垫上的NAG抗体Ⅰ或Ⅱ，与胶体金是按照2
‑
5μg/mL进行标记，胶体金标记的NAG抗体Ⅰ或Ⅱ的使用量为50μL/cm2。
[0014]优选地，所述反应垫的T线上包被的NAG抗体Ⅱ或Ⅰ的包被浓度为0.5
‑
3mg/mL，包被量为0.8
‑
1.2μL/cm。
[0015]优选地，所述反应垫的C线上包被有羊抗鼠IgG多克隆抗体，且包被浓度为0.5
‑
3mg/mL，包被量为0.8
‑
1.2μL/cm。
[0016]优选地，所述反应垫为孔径3
‑
15μm的硝酸纤维素膜。
[0017]本专利技术还提供了上述的胶体金试纸的制备方法，包括以下步骤：
[0018]S1、用氯化钠溶液分别配制用于包被所述反应垫的T线的NAG抗体Ⅰ或Ⅱ的工作液，以及包被所述反应垫的C线的多克隆抗体工作液；将NAG抗体Ⅰ或Ⅱ的工作液、多克隆抗体工作液分别包被到反应垫的T线和C线上，干燥备用；
[0019]制备胶体金复溶液，将胶体金和碳酸钾溶液混合均匀，然后相应地加入NAG抗体Ⅱ或Ⅰ，继续搅拌，再加入聚乙二醇，搅拌、离心，收集沉淀；将沉淀用所述胶体金复溶液复溶混合均匀，得到胶体金标记的NAG抗体Ⅱ或Ⅰ，并将其均匀铺到所述结合垫上，干燥密封备用；
[0020]S2、将处理好的样品垫、结合垫、反应垫、吸水垫依次粘贴在底板上，裁剪得到胶体金试纸成品。
[0021]与现有技术相比，本专利技术的有益之处在于：
[0022]1、本专利技术提供的一种基于免疫技术，利用双抗体夹心法原理和胶体金技术检测尿液中N
‑
乙酰
‑
β<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.检测N
‑
乙酰
‑
β
‑
D氨基葡萄糖苷酶的胶体金试纸，所述胶体金试纸包括底板，以及设在底板上的样品垫、结合垫、反应垫和吸水垫，其特征在于，所述结合垫上吸附有胶体金标记的NAG抗体Ⅰ或NAG抗体Ⅱ，相应地，所述反应垫的T线上包被有所述NAG抗体Ⅱ或所述NAG抗体Ⅰ；所述NAG抗体Ⅰ的重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.1
‑
3所示，轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.4
‑
5所示，轻链可变区的互补决定区CDR2的氨基酸序列为YAS；所述NAG抗体Ⅱ的重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.6
‑
8所示，轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.9
‑
10所示，轻链可变区的互补决定区CDR2的氨基酸序列为WAS。2.根据权利要求1所述的检测N
‑
乙酰
‑
β
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D氨基葡萄糖苷酶的胶体金试纸，其特征在于，所述NAG抗体Ⅰ的重链可变区的骨架区FR1、FR2、FR3、FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.11
‑
14所示，轻链可变区的骨架区FR1、FR2、FR3、FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.15
‑
18所示；所述NAG抗体Ⅱ的重链可变区的骨架区FR1、FR2、FR3、FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.19
‑
22所示，轻链可变区的骨架区FR1、FR2、FR3、FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.23
‑
26所示。3.根据权利要求2所述的检测N
‑
乙酰
‑
β
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D氨基葡萄糖苷酶的胶体金试纸，其特征在于，所述NAG抗体Ⅰ、NAG抗体Ⅱ的轻链恒定区均为κ链，重链恒定区均为IgG2a型。4.根据权利要求3所述的检测N
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乙酰
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β
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D氨基葡萄糖苷酶的胶体金试纸，其特征在于，所述NAG抗体Ⅰ的重链的...

【专利技术属性】
技术研发人员：陶曙，雷友林，杨光，邓丽，
申请(专利权)人：武汉勖瑞生物科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：