次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶合成制造技术

本发明专利技术公开了次黄嘌呤

【技术实现步骤摘要】
次黄嘌呤
‑
鸟嘌呤磷酸核糖转移酶合成
β
‑
烟酰胺单核苷酸的方法


[0001]本专利技术属于生物酶工程
，具体涉及次黄嘌呤
‑
鸟嘌呤磷酸核糖转移酶合成
β
‑
烟酰胺单核苷酸的方法，是一种以次黄嘌呤
‑
鸟嘌呤磷酸核糖转移酶为催化剂，立体选择性地催化烟酰胺与5‑
磷酸核糖
‑1‑
焦磷酸缩合获得
β
‑
烟酰胺单核苷酸的方法
。

技术介绍

[0002]β
‑
烟酰胺单核苷酸
(
β
‑
nicotinamide mononucleotide,NMN)
是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸
(Nicotinamide adenine dinucleotide,NAD,
又称辅酶Ⅰ)
的前体物质，是细胞内一个重要的中间代谢产物
。NAD
难以直接进入细胞，
NMN
作为合成
NAD
的直接前体，耐受性良好，并能够防止与年龄相关的生理衰退
(Mills KF,Yoshida S,Stein LR,et al.Long
‑
Term Administration of Nicotinamide Mononucleotide Mitigates Age
‑
Associated Physiological Decline in Mice.Cell Metab.2016,24,795
‑
806)
，因此作为
NAD
补充剂的首选物质
。
除此之外，
NMN
被证明通过逆转与衰老相关的线粒体功能障碍，在治疗高脂肪饮食诱导的2型糖尿病方面有效
(Haigis MC,Mostoslavsky R,Haigis KM,et al.SIRT4 inhibits glutamate dehydrogenase and opposes the effects of calorie restriction in pancreatic beta cells.Cell.2006,126,941
‑
954)。
但天然
NMN
在生物体内含量极低，无法通过分离提取获得
。
目前
NMN
传统制备方法是通过化学合成途径制备，但由于较难控制立体选择性，且收率较低，制备高纯度的
NMN
成本较高，以其为主要活性成分的产品十分昂贵
。
与化学合成比较，生物酶法合成
NMN
具有高效环保的优势，无有机溶剂残留且不存在手性问题
。
目前催化
NMN
合成的烟酰胺磷酸核糖转移酶受到其分子量大
、
结构复杂
、
不易定向进化等因素的限制，可用于合成
NMN
的新型高效磷酸核糖转移酶仍亟待开发
。
[0003]次黄嘌呤
‑
鸟嘌呤磷酸核糖转移酶
(Hypoxanthine
‑
guanine phosphoribosyltransferase,HGPRT)
，属于6‑
氧代嘌呤磷酸核糖基转移酶
(PRTase)
家族，目前报道的生物学功能为催化鸟嘌呤
/
次黄嘌呤与5‑
磷酸核糖
‑1‑
焦磷酸
(PRPP)
缩合生成鸟嘌呤
/
次黄嘌呤核苷单磷酸
(GMP/IMP)
，是鸟嘌呤和次黄嘌呤补救合成途径关键酶
。

技术实现思路

[0004]本专利技术目的在于提供一种次黄嘌呤
‑
鸟嘌呤磷酸核糖转移酶合成
β
‑
烟酰胺单核苷酸
(NMN)
的方法，是一种应用次黄嘌呤
‑
鸟嘌呤磷酸核糖转移酶立体选择性催化烟酰胺
(NAM)
与5‑
磷酸核糖
‑1‑
焦磷酸
(PRPP)
缩合获得
NMN
的方法，是次黄嘌呤
‑
鸟嘌呤磷酸核糖转移酶底物谱的扩展应用
。
[0005]本专利技术提供的方法，以
NAM
和
PRPP
为原料，以
Mg
2+
为辅因子，经次黄嘌呤
‑
鸟嘌呤磷酸核糖转移酶催催化获得
NMN。
[0006]具体步骤为：以
NAM
和
PRPP
为原料，以
Mg
2+
为辅因子，在酶催化体系中的次黄嘌呤
‑
鸟嘌呤磷酸核糖转移酶的催化下，缩合获得
NMN
，反应式如下：
[0007][0008]在反应过程中
NAM
与
PRPP
作为底物，但由于
PRPP
价格昂贵，且易分解，通过
PRPP
合成系统合成
PRPP
，可显著降低反应成本
。
[0009]本专利技术中，所述
PRPP
合成系统为：以核糖激酶和磷酸核糖焦磷酸激酶作为系统关键酶
、
以
ATP
与
D
‑
核糖为底物
、
以
Mg
2+
作为辅因子的
PRPP
合成系统
。
[0010]因此，本专利技术所述
NMN
酶催化合成体系也包括
PRPP
合成系统，酶体系中包括次黄嘌呤
‑
鸟嘌呤磷酸核糖转移酶
、
核糖激酶
、
磷酸核糖焦磷酸激酶和氯化镁
。
所述酶催化体系中次黄嘌呤
‑
鸟嘌呤磷酸核糖转移酶
、
核糖激酶与磷酸核糖焦磷酸激酶纯化后均为游离纯酶
。
向该酶反应体系加入
ATP、D
‑
核糖
、NAM
与
PRPP
，在控制
pH
和温度的条件下，
Mg
2+
作为辅因子，
ATP
在核糖激酶的催化下将
D
‑
核糖磷酸化为5‑
磷酸核糖，进而在磷酸核糖焦磷酸激酶的催化下将5‑
磷酸核糖磷酸化为
PRPP
，最后次黄嘌呤
‑
鸟嘌呤磷酸核糖转移酶将
NAM
与
PRPP
缩合生成
NMN
，反应式如下：<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种次黄嘌呤
‑
鸟嘌呤磷酸核糖转移酶合成
β
‑
烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于，以烟酰胺与5‑
磷酸核糖
‑1‑
焦磷酸为底物，经酶催化体系催化获得
β
‑
烟酰胺单核苷酸，所述酶催化体系由次黄嘌呤
‑
鸟嘌呤磷酸核糖转移酶和
PRPP
合成系统组成
。2.
根据权利要求1所述的方法，其特征在于，通过以下步骤实现：以烟酰胺与5‑
磷酸核糖
‑1‑
焦磷酸为原料，以
Mg
2+
为辅因子，在酶催化体系中的次黄嘌呤
‑
鸟嘌呤磷酸核糖转移酶的催化下，将底物进行缩合得到
β
‑
烟酰胺单核苷酸，反应式：反应以
PRPP
的合成为前提，通过
PRPP
合成系统，以
ATP
与
D
‑
核糖为底物，经核糖激酶
、
磷酸核糖焦磷酸激酶两次催化磷酸化反应，合成
PRPP。3.
根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，编码次黄嘌呤
‑
鸟嘌呤磷酸核糖转移酶的核苷酸序列如
SEQ.No.1
所示，其氨基酸序列如
SEQ.No.2
所示
。4.
根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述
PRPP
合成系统为：以核糖激酶和磷酸核糖焦磷酸激酶作为系统关键酶
、
以
ATP
与
D
‑
核糖为底物
、
以
Mg
2+
作为辅因子，以
Mg
2+
作为辅因子，
ATP
在核糖激酶的催化下将
D
‑
核糖磷酸化为5‑
磷酸核糖，进而在磷酸核糖焦磷酸激酶的催化下将5‑
磷酸核糖磷酸化为
PRPP
，
PRPP
作为次黄嘌呤
‑
鸟嘌呤磷酸核糖转移酶的底物，与
NAM
缩合生成
NMN
，反应式如下：
5.
根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述酶催化体系包括次黄嘌呤
‑
鸟嘌呤磷酸核糖转移酶
、
核糖激酶
、
磷酸核糖焦磷酸激酶<...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙莲莉，刘洋，林翠颖，范宇哲，
申请(专利权)人：浙江大学金华研究院，
类型：发明
国别省市：