一种双功能酶生物催化剂及其制备方法和应用技术

本发明专利技术属于生物技术领域，涉及一种双功能酶生物催化剂及其制备方法和应用

【技术实现步骤摘要】
一种双功能酶生物催化剂及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于生物
，涉及一种双功能酶生物催化剂及其制备方法和应用
。

技术介绍

[0002]3‑
奎宁醇是很多抗胆碱药物的重要中间体，例如索利那辛
、
瑞伐托酯等都是含有 R
‑3‑
奎宁醇结构的最新抗胆碱药物，对于治疗尿失禁和慢性阻塞性肺病（
COPD
）有很好的疗效，而是用于治疗有尿急
、
尿频症状的膀胱过度活动症原料药琥珀酸索菲那新的中间体；索非那新中间体
。3
‑
奎宁醇品质的好坏以及价格的高低对于由其合成药物的品质及生产成本有着很重要的影响
。
因此对3‑
奎宁醇合成的研究具有很重要的意义
。
[0003]目前，国内外文献专利所报道的3‑
奎宁醇的合成方法主要是化学法和生物法两种
。
与传统化学合成技术相比，羰基的不对称生物还原具有立体选择性强
、
转化效率高
、
反应条件温和
、
以及生产过程对环境友好等优势
。
因此，近年来利用羰基还原酶不对称还原
R/S
‑3‑
奎宁醇成为生产该类手性醇的方法
。
例如，以奎宁酮盐酸盐为底物催化合成
R
‑3‑
奎宁醇（
Zhenhua Jia, Hong Ma, Yali, Huang et al.. Production of (R)
‑3‑
quinuclidinol by a whole
‑
cell biocatalyst with high efficiency.Biocatalysis and Biotransformation,2017, 36:4, 316
‑
323
；专利：
CN106282135B
）；张雅飞
,
冯进辉
,
李键煚
,
王玉
,
王敏
,
吴洽庆
,
朱敦明
.
酶催化奎宁酮不对称还原合成
(S)
‑3‑
奎宁醇
[J].
应用与环境生物学报
,2016,22(05):854
‑
859.。
而消旋体奎宁醇的合成仅仅是利用化学合成方法完成，目前没有利用生物催化方法合成消旋体奎宁醇的报道
。
而开发一些新型
、
高效
、
稳定，能够适应多变生产环境的生物酶催化合成消旋体奎宁醇对于工业制备3‑
奎宁醇具有重要的研究意义和实际应用价值
。
[0004]生物催化合成手性醇具有立体选择性高
、
催化活性高
、
环境友好
、
反应条件温和等独特优势，往往需要偶联辅酶进行催化反应，
Zhenhua Jia
等
(Biocatalysis and Biotransformation,2017, 36:4, 316
‑
323)
选用葡萄糖脱氢酶借助还原型辅酶
(NAD+)
，利用酶偶联方法将奎宁酮还原制备
R
‑3‑
奎宁醇
。
酶偶联方法须表达葡萄糖脱氢酶，而羰基还原氨化和辅酶再生在两个独立菌体中完成，辅酶必须在两个不同菌体之间转运扩散，但受菌体自身结构限制和自由扩散影响，辅酶在两个菌体间的传质阻力导致生物转化时间长，转化效率低
。
同时需要两种酶才能完成生物转化过程，导致成本增加，不利于工业化
。

技术实现思路

[0005]本专利技术所要解决的技术问题是合成3‑
奎宁醇
。
[0006]为解决上述技术问题，本专利技术首先提供了一种利用生物酶催化合成3‑
奎宁醇的方法，可包括如下步骤
(
反应原理见图
1)
：以奎宁环酮盐酸盐为底物，经双功能酶及其辅酶催化反应生成3‑
奎宁醇；进一步地，所述双功酶来源于如下任一微生物：地芽孢杆菌
、
嗜热脂肪地芽孢杆菌
、
热链地芽孢杆菌
、
嗜热地芽孢杆菌
、
立陶宛地芽孢杆菌
、
热溶芽孢杆菌
、
好热地芽孢杆
菌
、
侏罗纪地质芽孢杆菌
、
副土芽孢杆菌
、
嗜热糖球菌
、
就地堆肥地芽孢杆菌
、
卡氏土芽孢杆菌
、
南极热棒杆菌
、
热葡糖苷酶地芽孢杆菌
、
热解蛋白无氧芽孢杆菌
、
解淀粉芽孢杆菌
、
喜温无氧芽孢杆菌；所述双功酶为如下
(a1)
ꢀ‑ꢀ
(a17)
中任一：
(a1)
来源于地芽孢杆菌
(Geobacillus)
的双功酶，氨基酸序列为
SEQ ID No.2
；
(a2)
来源于嗜热脂肪地芽孢杆菌（
Geobacillus stearothermophilus
）的双功酶，氨基酸序列为
SEQ ID No.4
；
(a3)
来源于热链地芽孢杆菌（
Geobacillus thermocatenulatus
）的双功酶，氨基酸序列为
SEQ ID No.6
；
(a4)
来源于嗜热地芽孢杆菌（
Geobacillus zalihae
）的双功酶，氨基酸序列为
SEQ ID No.8
；
(a5)
来源于立陶宛地芽孢杆菌（
Geobacillus lituanicus
）的双功酶，氨基酸序列为
SEQ ID No.10
；
(a6)
来源于热溶芽孢杆菌（
Bacillus caldolyticus
）的双功酶，氨基酸序
SEQ ID No.12
；
(a7)
来源于好热地芽孢杆菌（
Geobacillus kaustophilus
）的双功酶，氨基酸序列为
SEQ ID No.14
；
(a8)
来源于侏罗纪地质芽孢杆菌（
Geobacillus jurassicus
）的双功酶，氨基酸序列为
SEQ ID No.16
；
(a9)
来源于副土芽孢杆菌（
Parageobacillus
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种具有葡萄糖脱氢及羰基还原的双功能酶
GeADH
，所述双功能酶
GeADH
具有如下
(a1)
ꢀ‑ꢀ
(a17)
中任一所示的来源和氨基酸序列：
(a1)
来源于地芽孢杆菌
(Geobacillus)
的双功酶，氨基酸序列为
SEQ ID No.2
；
(a2)
来源于嗜热脂肪地芽孢杆菌（
Geobacillus stearothermophilus
）的双功酶，氨基酸序列为
SEQ ID No.4
；
(a3)
来源于热链地芽孢杆菌（
Geobacillus thermocatenulatus
）的双功酶，氨基酸序列为
SEQ ID No.6
；
(a4)
来源于嗜热地芽孢杆菌（
Geobacillus zalihae
）的双功酶，氨基酸序列为
SEQ ID No.8
；
(a5)
来源于立陶宛地芽孢杆菌（
Geobacillus lituanicus
）的双功酶，氨基酸序列为
SEQ ID No.10
；
(a6)
来源于热溶芽孢杆菌（
Bacillus caldolyticus
）的双功酶，氨基酸序
SEQ ID No.12
；
(a7)
来源于好热地芽孢杆菌（
Geobacillus kaustophilus
）的双功酶，氨基酸序列为
SEQ ID No.14
；
(a8)
来源于侏罗纪地质芽孢杆菌（
Geobacillus jurassicus
）的双功酶，氨基酸序列为
SEQ ID No.16
；
(a9)
来源于副土芽孢杆菌（
Parageobacillus
）的双功酶，氨基酸序列为
SEQ ID No.18
；
(a10)
来源于嗜热糖球菌（
Saccharococcus thermophilus
）的双功酶，氨基酸序列为
SEQ ID No.20
；
(a11)
来源于就地堆肥地芽孢杆菌（
Parageobacillus toebii
）的双功酶，氨基酸序列为
SEQ ID No.22
；
(a12)
来源于卡氏土芽孢杆菌（
Parageobacillus caldoxylosilyticus
）的双功酶，氨基酸序列为
SEQ ID No.24
；
(a13)
来源于南极热棒杆菌（
Parageobacillus thermantarcticus
）的双功酶，氨基酸序列为
SEQ ID No.26
；
(a14)
来源热葡糖苷酶地芽孢杆菌（
Parageobacillus thermoglucosidasius
）的双功酶，氨基酸序列为
SEQ ID No.28
；
(a15)
来源于热解蛋白无氧芽孢杆菌（
Anoxybacillus caldiproteolyticus
）的双功酶，氨基酸序列为
SEQ ID No.30
；
(a16)
来源于解淀粉芽孢杆菌（
Anoxybacillus amylolyticus
）的双功酶，氨基酸序列为
SEQ ID No.32
；
(a17)
来源于喜温无氧芽孢杆菌（
Anoxybacillus tepidamans
）的双功酶，氨基酸序列为
SEQ ID No.34
；
(a18)
在
(1)
‑ꢀ
(17)
中任一所限定的蛋白质的
N
端和
/
或
C
端连接标签后得到的融合蛋白
。2.
根据权利要求1所述双功能酶
GeADH
，其特征在于，所述双功能酶
GeADH
以粗酶液
、
粗酶液冻干粉
、
纯酶或全细胞的形式发生催化作用
。3. 权利要求所述双功能酶
GeADH
的突变体，其特征在于，所述突变体包括如下
(b1)
ꢀ‑ꢀ
(b3)
任一项所示的突变：
(b1)SEQ ID No . 2
所示的双功酶存在如下突变中的至少一种
:Q135N、K249A
；
(b2)SEQ ID No . 4
所示的双功酶存在如下突变中的至少一种
: L86W、Q188N
；
(b3)
在
(b1)
ꢀ‑ꢀ
(b2)
中任一所限定的蛋白质的
N
端和
/
或
C
端连接标签后得到的融合蛋白
。4.
权利要求1或2所述双功能酶
GeADH
或权利要求3所述突变体的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：向宿主细胞中导入能够表达所述双功能酶
GeADH
或突变体的核酸分子，经诱导培养后获得表达所述双功能酶
GeADH
或突变体的重组细胞，所述重组细胞即为全细胞；裂解所述重组细胞获得粗酶液
、
粗酶液冻干粉或纯酶
。5.
根据权利要求4所述生产方法，其特征在于，通过重组载体的形式将所述核酸分子导入到所述宿主细胞中；所述重组载体为携带有所述双功能酶
GeADH
或突变体的编码基因的细菌质粒
、
噬菌体
、
酵母质粒或逆转录病毒包装质粒
。6.
...

【专利技术属性】
技术研发人员：贾振华，周一鸣，宋聪，张翔，李冉，赵芊，宋水山，
申请(专利权)人：河北省科学院生物研究所，
类型：发明
国别省市：