检测残留的盐酸克伦特罗的酶联免疫试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术公开了一种检测残留的盐酸克伦特罗的酶联免疫试剂盒及其检测方法。所述试剂盒包括：预包被葡萄球菌蛋白Ａ和包被ＣＢＬ抗体的微孔板（１）、ＣＢＬ标准品（２）、浓缩洗涤液（３）、浓缩酶标ＣＢＬ（４）、酶标稀释液（５）、底物液（６）和终止液（７）。本发明专利技术的试剂盒采用直接竞争法，即标准品或待测样品中的ＣＢＬ和酶标ＣＢＬ竞争微孔板上的ＣＢＬ抗体。该方法可以用于直接检测动物源性食品、尿液和血清样品中的盐酸克伦特罗，其操作更简便、快捷，且操作时间仅需５０分钟，灵敏度可达０．０２μｇ／ｋｇ。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种用于，属于酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA)
更具体 地，本专利技术涉及用于检测动物源食品、血液及尿液中残留的盐酸克伦特罗(CBL)的含量的 酶联免疫试剂盒以及使用该试剂盒的检测方法。
技术介绍
盐酸克伦特罗(clenbuterol，CBL)是一种β _2肾上腺受体激动剂，临床上作为支 气管解痉药物，对支气管平滑肌β-2受体具有兴奋作用。有研究显示盐酸克伦特罗能增强 脂肪分解和减慢蛋白质分解代谢，在畜牧生产中大剂量使用可以明显提高饲料转化率和瘦 肉率，因此又被称为瘦肉精。但是，如果盐酸克伦特罗的用量过大，则会对动物和人的肝脏、肾脏等器官造成相 当大的毒害作用，出现心跳加速、头晕、心悸、呼吸困难、肌肉震颤和头疼等中毒症状。盐酸 克伦特罗还可通过胎酶标板屏障进入胎儿体内产生蓄积，从而对子代产生严重的危害。欧 盟于1996年禁止在畜牧生产中使用该药，我国农业部也于1997年作出相同规定。但由于 经济利益的驱使，目前在畜牧生产中使用盐酸克伦特罗的现象仍然存在，每年都有大规模 中毒事件发生。当前，造成瘦肉精屡禁不止的原因之一就是国内外检测盐酸克伦特罗的方法、手 段还不完善。存在的问题主要有检测方法灵敏度不高，准确度不够；特异性差，操作复杂， 不能普及到基层。目前盐酸克伦特罗的检测方法主要有色谱技术和免疫分析技术。色谱技 术由于费时，花费多，在实际应用中受到一定限制，通常作为确定性的定量检验方法；酶联 免疫分析方法(ELISA)是常用的现场抽样快速筛选检验方法，目前我国进出口检验检疫， 兽医卫生部门及屠宰场多采用德国R-Biopharm公司生产的盐酸克伦特罗ELISA检测试剂 盒(货号R1701)，但由于进口试剂价格昂贵，在一定程度上限制了它的使用范围。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是，提供一种能够快速且准确地检测出残留的盐酸克 伦特罗的酶联免疫试剂盒。本专利技术所要解决的另一技术问题是提供一种操作简单、耗时短 且检测灵敏度高的检测残留的盐酸克伦特罗的方法。为解决所述技术问题，本专利技术的专利技术人通过深入研究和大量实验，提供以下技术 方案来解决所述技术问题1. 一种检测残留的盐酸克伦特罗的酶联免疫试剂盒，包括微孔板(1)、盐酸克伦 特罗标准品(2)、浓缩洗涤液(3)、浓缩酶标盐酸克伦特罗(4)、酶标稀释液(5)、底物液(6) 和终止液(7)，其中，所述微孔板(1)是预先包被葡萄球菌蛋白A，然后包被兔抗盐酸克伦特罗抗 体的微孔板，所述预先包被葡萄球菌蛋白A是用0. 05mol/L的pH值为9. 6的Na2CO3-NaHCO3缓冲液将葡萄球菌蛋白A稀释至lyg/ml，按每孔100 yl的量添加到微孔板板⑴中，4°C 放置过夜，弃去包被液，用稀释后的浓缩洗涤液洗板3次。2.根据上述第1项所述的检测残留的盐酸克伦特罗的酶联免疫试剂盒，其中，所 述微孔板包被兔抗盐酸克伦特罗抗体是用0. 05mol/L的pH值为7. 4的磷酸盐缓冲液(PBS) 将兔抗盐酸克伦特罗抗体以1 50，000比例稀释，按每孔100 yl的量添加到微孔板中， 4°C放置过夜，弃去包被液，用稀释后的浓缩洗涤液洗板3次，然后真空抽干，将微孔板密封 后置-20°C下保存。3.根据上述第1项所述的检测残留的盐酸克伦特罗的酶联免疫试剂盒，其中，所 述盐酸克伦特罗标准品(2)的浓度分别为0 u g/kg、0. 02 u g/kg、0. 06 u g/kg、0. 18 u g/kg、 0. 54 u g/kg 和 1. 6 ii g/kg。4.根据上述第1项所述的检测残留的盐酸克伦特罗的酶联免疫试剂盒，其中，所 述浓缩洗涤液(3)是5 10倍浓缩洗涤液，即在使用时将该浓缩洗涤液稀释5 10倍；所述酶标稀释液(5)是由小牛血清和所述洗涤液按体积比1 9组成；所述浓缩酶标盐酸克伦特罗(4)是10 100倍的浓缩酶标盐酸克伦特罗，采用重 氮化-偶联的方法将辣根过氧化物酶(HRP)标记到盐酸克伦特罗(CBL)上，用酶联免疫吸 附试验测定酶标CBL原液的工作浓度，将酶标CBL原液用含10%小牛血清(体积比)的PBS 稀释至工作浓度(浓度在0. 1 u g/mL 1 y g/mL范围内)的10 100倍，该酶标CBL溶液 即为10 100倍浓缩酶标CBL ；所述底物液(6)包含5. 37g/L的一水柠檬酸(C6H807 H20)、19. 38g/L的 Na2HP04 12H20、50mg/L 的 3，3，，5，5，-四甲基联苯胺(TMB)、25mg/L 的过氧化氢脲和 5% (体积比)的N，N- 二甲基甲酰胺；所述终止液(7)是0. 5mol/L的盐酸。5.根据上述第4项所述的检测残留的盐酸克伦特罗的酶联免疫试剂盒，其 中，所述浓缩洗涤液是10倍浓缩洗涤液，其包含80g/L的NaCl、2g/L的KCl、29g/L的 Na2HP04. 12H20、2g/L的KH2P04和5ml/L的吐温-20 ；以及所述浓缩酶标盐酸克伦特罗是20 倍的浓缩酶标盐酸克伦特罗。6. 一种用上述第1项所述试剂盒检测残留的盐酸克伦特罗的酶联免疫方法，其是 基于抗原抗体反应进行竞争性抑制测定的方法，该方法包括以下步骤(I)预处理待测样品，即将待测试的样品处理为液体样品，或者用有机溶剂提取待 测样品、蒸干并且将其复溶于PBS ；(II)取包被葡萄球菌蛋白A和盐酸克伦特罗抗体的包被板，加入50 ii L盐酸克伦 特罗标准品和处理后的样品到对应微孔中；(III)加入100 u L用酶标稀释液(5)将所述浓缩酶标盐酸克伦特罗稀释至工作浓 度的酶标盐酸克伦特罗，振荡混勻后于37°C下避光静置孵育30分钟，用稀释后的浓缩洗涤 液洗涤3次，在吸水纸上拍干；(IV)加入100 u L底物液，于室温下避光静置10分钟，加入100 u L反应终止液到 微孔中，混合好后立即在450nm或双波长450歷/630歷测量吸光度值；(V)以标准品测试的吸光度比值与标准品的浓度对数值绘制标准曲线，对照标准 曲线计算样品中盐酸克伦特罗的含量。7.根据上述第6项所述的方法，其中，在步骤(II)中，盐酸克伦特罗标准品和处理 好的样品同时添加到对应微孔中。8.根据上述第6或7项所述的方法，其中，所述处理后的样品是经过以下处理的样品。1)取尿液样品，离心(离心力为12000g)2分钟后取上清，用0. 15mol/L的pH值为 7. 4的磷酸盐缓冲液(PBS)稀释1倍；2)取血清样品，离心(离心力为12000g)2分钟后取上清，用0. 15mol/L的pH值为 7. 4的磷酸盐缓冲液(PBS)稀释1倍；3)取3. 0克已均质后的猪肉样品于离心管中，加入6mL乙酸乙酯，漩涡混合1分 钟，然后离心(转速3000rpm)10分钟，取2mL上层液(乙酸乙酯)，在50°C下氮气吹干，再 加入正己烷lmL，待残余物完全溶解后，再加入lmL的含0. 05%的吐温-20的磷酸盐缓冲液 (PBST)，漩涡混合30秒钟。离心(3000rpm) 10分钟，吸去包含中间乳化层部分的上层液(正 己烷)，吸取下层液(水层)作为处理后的样品。本专利技术采用酶联免疫吸附试验(E本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测残留的盐酸克伦特罗的酶联免疫试剂盒，包括微孔板（１）、盐酸克伦特罗标准品（２）、浓缩洗涤液（３）、浓缩酶标盐酸克伦特罗（４）、酶标稀释液（５）、底物液（６）和终止液（７），　　其中，所述微孔板（１）是预先包被葡萄球菌蛋白Ａ，然后包被兔抗盐酸克伦特罗抗体的微孔板，所述预先包被葡萄球菌蛋白Ａ是用０．０５ｍｏｌ／Ｌ的ｐＨ值为９．６的Ｎａ↓［２］ＣＯ↓［３］－ＮａＨＣＯ↓［３］缓冲液将葡萄球菌蛋白Ａ稀释至１μｇ／ｍｌ，按每孔１００μｌ的量添加到微孔板板（１）中，４℃放置过夜，弃去包被液，用稀释后的浓缩洗涤液洗板３次。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：不公告发明人，
申请(专利权)人：北京阿匹斯生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]