抑制制造技术

本发明专利技术提供了一种抑制

【技术实现步骤摘要】
抑制PCSK9基因表达的siRNA的制备方法


[0001]本专利技术涉及药物生物合成领域，具体而言，涉及一种抑制
PCSK9
基因表达的
siRNA
的制备方法
。

技术介绍

[0002]许多疾病是由基因异常表达及突变引起的，然而这些疾病往往不能够被传统的小分子药物所治愈，有效的基因表达干预成为治疗这类疾病的唯一方法
。siRNA
是一种双链 RNA
的寡核苷酸，大小为
19~21
个碱基对
。
在生物体中，
siRNA
介导的
RNA
干扰（
RNAi
）所引起的基因沉默，是一种重要的基因表达调控方式，其可特异性引发靶
mRNA
降解，抑制基因表达
。RNA
干扰（
RNAi
）现象被发现之后，该技术迅速被科研人员应用于疾病治疗领域，使基因治疗的发展迎来了巨大的契机
。
该技术通过导入小干扰
RNA
（
siRNA
）特异性抑制致病靶向基因的表达，起到治疗疾病的作用
。2018
年，美国
FDA
批准用于治疗由遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样变性引起的周围神经疾病的
siRNA
药物，填补了
siRNA
药物延伸领域的空白，为接下来
siRNA
药物的发展开辟了先河
。
目前全球由5款获批上市的
siRNA
疗法，随着用于治疗高胆固醇血症的
siRNA
药物开发，
siRNA
药物正在成为药物治疗的标准模式
。siRNA
药物一般能够从源头进行干预，具有“治标治本”的特点，靶点筛选快
、
治疗效率高
、
药物毒性低
、
特异性强的优点，作用持续时间可达半年之久
。
可实现患者一年两次的用药频率，是非常有前景的治疗方式
。
[0003]siRNA
的合成主要依靠亚磷酰胺法进行合成，该方法包括去保护
、
偶联
、
加帽及氧化 4 个步骤
。
但随着链长的延长，化学反应效率
、
合成纯度以及产率下降严重，该方法合成的
Oligo
长度一般不会超过
200
个核苷酸（
nt
），同时在合成过程中会使用大量的有机溶剂，极大的增加了反应成本和三废处理的成本，同时也增加了环境污染的负担
。
同时在反应的过程中会产生难于去除的
N+1
杂质和
N
‑1杂质，随着链长的增加杂质的产生会急剧的增多，增加了后处理的难度，极大的降低了收率
。
随着
siRNA
用于治疗常见病的普及，对
siRNA
的需求将会极大的增加，但目前的合成方法由于设备受限，在放大生产上由较大的难度，因此需要开发一种更加高效绿色的
siRNA
的合成方法
。

技术实现思路

[0004]本专利技术的主要目的在于提供一种抑制
PCSK9
基因表达的
siRNA
的制备方法，以解决现有技术中的制备此种
siRNA
纯度较低的问题
。
[0005]为了实现上述目的，根据本专利技术的第一个方面，提供了一种抑制
PCSK9
基因表达的
siRNA
的制备方法，
siRNA
为为由互补配对的正义链和反义链组成的双链
RNA
；制备方法包括：将正义链底物
、
反义链底物和
RNA
连接酶混合，利用
RNA
连接酶催化正义链底物之间和反义链底物之间以磷酸二酯键连接，获得正义链和反义链，从而获得此种
siRNA
；正义链底物能够组成正义链，反义链底物能够组成反义链，正义链为
SEQ ID NO
：
45
所示的核酸序列，反义链为
SEQ ID NO
：
46
所示的核酸序列
。
[0006]进一步地，正义链的5’
端为羟基，3’
端为
L96
基团，正义链的
1、2、3、4、5、6、8、10、12、13、14、15、16、17、18、19、20
和
21
位核糖核苷酸上具有
2'
甲氧基修饰；第7和9位核糖核苷酸上具有
2'
氟修饰；第1和2位核糖核苷酸间为硫代磷酸酯连接，第2和3位核糖核苷酸间为硫代磷酸酯连接；第
11
位为脱氧核糖核苷酸，为胸腺嘧啶；反义链的5’
端为羟基，3’
端为羟基，反义链的第
1、3、7、9、11
和
13、15、17、19、20、21、22
和
23
位核糖核苷酸上具有
2'
甲氧基修饰，第
2、4、5、6、8、10、12、14、16
和
18
位核糖核苷酸上具有
2'
氟修饰，第1和2位核糖核苷酸间为硫代磷酸酯连接，第2和3位核糖核苷酸间为硫代磷酸酯连接，第
21
和
22
位核糖核苷酸间为硫代磷酸酯连接，第
22
和
23
位核糖核苷酸间为硫代磷酸酯连接
。
[0007]进一步地，
RNA
连接酶包括
SEQ ID NO
：
4~SEQ ID NO
：
10
或
SEQ ID NO
：
13 ~ SEQ ID NO
：
40
所示的
RNA
连接酶中的一种或多种；或与
SEQ ID NO
：
4~ SEQ ID NO
：
10、SEQ ID NO
：
13~SEQ ID NO
：
40
中所示的任一
RNA
连接酶具有
70%
以上同一性，且具有催化磷酸二酯键形成活性的酶
。
[0008]进一步地，正义链底物包括2条或更多条底物，反义链底物包括2条或更多条底物；优选地，正义链底物的长度为2‑
19 nt
，更优选为3‑
17 nt
，进一步优选为6‑
15 nt
；优选地，反义链底物的长度为2‑
21 nt
，更优选为3‑
19 nt
，进一步优选为6‑
15本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种抑制
PCSK9
基因表达的
siRNA
的制备方法，其特征在于，所述
siRNA
为由互补配对的正义链和反义链组成的双链
RNA
；所述制备方法包括：将正义链底物
、
反义链底物和
RNA
连接酶混合，利用所述
RNA
连接酶催化所述正义链底物之间和反义链底物之间以磷酸二酯键连接，获得所述正义链和所述反义链，从而获得所述
siRNA
；所述正义链底物能够组成所述正义链，所述反义链底物能够组成所述反义链；所述正义链为
SEQ ID NO
：
45
所示的核酸序列，所述反义链为
SEQ ID NO
：
46
所示的核酸序列
。2.
根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述正义链的5’
端为羟基，3’
端为
L96
基团，所述正义链的
1、2、3、4、5、6、8、10、12、13、14、15、16、17、18、19、20
和
21
位核糖核苷酸上具有
2'
甲氧基修饰；第7和9位核糖核苷酸上具有
2'
氟修饰；第1和2位核糖核苷酸间为硫代磷酸酯连接，第2和3位核糖核苷酸间为硫代磷酸酯连接；第
11
位为脱氧核糖核苷酸，为胸腺嘧啶；所述反义链的5’
端为羟基，3’
端为羟基，所述反义链的第
1、3、7、9、11、13、15、17、19、20、21、22
和
23
位核糖核苷酸上具有
2'
甲氧基修饰，第
2、4、5、6、8、10、12、14、16
和
18
位核糖核苷酸上具有
2'
氟修饰，第1和2位核糖核苷酸间为硫代磷酸酯连接，第2和3位核糖核苷酸间为硫代磷酸酯连接，第
21
和
22
位核糖核苷酸间为硫代磷酸酯连接，第
22
和
23
位核糖核苷酸间为硫代磷酸酯连接
。3.
根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述
RNA
连接酶包括
SEQ ID NO
：
4~SEQ ID NO
：
10
或
SEQ ID NO
：
13 ~ SEQ ID NO
：
40
所示的
RNA
连接酶中的一种或多种；或与
SEQ ID NO
：
4~ SEQ ID NO
：
10、SEQ ID NO
：
13~SEQ ID NO
：
40
中所示的任一
RNA
连接酶具有
70%
以上同一性，且具有催化所述磷酸二酯键形成活性的酶
。4.
根据权利要求1‑3中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述正义链底物包括2条或更多条底物，所述反义链底物包括2条或更多条底物
。5.
根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述正义链底物的长度为2‑
19 nt
，所述反义链底物的长度为2‑
21 nt。6.
根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述正义链底物和所述反义链底物均包括2条底物，所述正义链底物包括第一正义链底物和第二正义链底物，所述反义链底物包括第一反义链底物和第二反义链底物；所述制备方法包括：将所述第一正义链底物
、
所述第二正义链底物
、
所述第一反义链底物和所述第二反义链底物混合，利用
RNA
连接酶催化所述第一正义链底物和所述第二正义链底物连接形成所述正义链，催化所述第一反义链底物和所述第二反义链底物连接形成所述反义链，所述正义链和所述反义链互补配对形成所述
siRNA。7.
根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，将所述正义链底物和所述反义链底物退火后与所述
RNA
...

【专利技术属性】
技术研发人员：洪浩，詹姆斯，
申请(专利权)人：天津凯莱英制药有限公司，
类型：发明
国别省市：