一种制造技术

本发明专利技术公开了一种

【技术实现步骤摘要】
一种ST
‑
Beclin1
‑
GFP细胞系的构建方法及其产品和应用


[0001]本专利技术涉及一种利用分子生物学技术建立稳定表达
Beclin1
蛋白的
ST
细胞系，尤其涉及一种
ST
‑
Beclin1
‑
GFP
细胞系的构建方法及其产品和应用，属于动物细胞工程

。

技术介绍

[0002]猪瘟
(Classical swine fever
，
CSF)
是由猪瘟病毒
(Classical swine fever Virus
，
CSFV)
引起的一种传染性极强且临床以高热
、
出血和免疫抑制为表征的烈性传染病，对养猪业造成巨大的经济损失
。CSFV
归属于黄病毒科
、
瘟病毒属，是一种单股正链
RNA
病毒，其直径在
40
‑
60nm
之间，基因组大小约为
12.5kb。CSFV
编码产生4个结构蛋白
(Core、Erns、E1
和
E2)
和8个非结构蛋白
(Npro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A
和
NS5B)。
[0003]CSFV
可在猪的骨髓
、
睾丸
、
肾等细胞培养物中繁殖，但无细胞病变
。
病毒感染时间及培养方式对
CSFV
增殖效果具有重要影响；细胞的初始感染率较低，在培养至
48h
后仅可以观察到大约
30
％的阳性细胞
。
相关研究证实病毒感染靶细胞数量
(
阳性感染
)
的多少与病毒增殖滴度的高低成明显正相关
。
敏感性靶细胞的探索不仅为进一步提高
CSFV
体外增殖滴度打下基础，而且对揭示
CSFV
感染的致病机制亦具有重要意义
。
日前猪瘟病毒的防控以疫苗接种为主，
CSFV
疫苗的工业化规模生产主要采用
ST
细胞，其中主要制备的是
CSFV C
株兔化弱毒疫苗
。
但是，传统
CSFV C
株兔化弱毒疫苗具有生产成本高
、
病毒滴度低
、
批间差异大
、
生产不可控等问题
。
因此，亟需一种可稳定表达宿主
Beclin1
基因的
ST
细胞系
。

技术实现思路

[0004]专利技术目的：本专利技术所要解决的技术问题是提供了一种生长速度
、
细胞形态和增殖速度与野生的
ST
细胞系相比无差异的
、
稳定表达宿主
Beclin1
基因的
ST
细胞系
ST
‑
Beclin1
‑
GFP
细胞系及其构建方法和应用
。
[0005]技术方案：为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种构建重组质粒
Beclin1
‑
GFP
的方法，包括以下步骤：
PCR
扩增
Beclin1
基因，酶切，克隆至
pEGFP
‑
C1
载体上，获得重组质粒
Beclin1
‑
GFP
；所述
PCR
扩增
Beclin1
基因中的引物组合如
SEQ ID NO.1
～4所示
。
[0006]本专利技术还提供了一种由所述方法构建的重组质粒
Beclin1
‑
GFP。
[0007]本专利技术还提供了一种构建
ST
‑
Beclin1
‑
GFP
细胞系的方法，包括以下步骤：将所述方法构建的重组质粒
Beclin1
‑
GFP
转染至猪肾细胞系，即获得
ST
‑
Beclin1
‑
GFP
细胞系
。
[0008]本专利技术还提供了一种由所述方法构建得到的
ST
‑
Beclin1
‑
GFP
细胞系
。
[0009]本专利技术还提供了一种猪睾丸细胞
ST
‑
Beclein1
，其保藏于中国典型培养物保藏中心
(CCTCC)
，保藏日期为
2023
年4月
25
日，保藏编号为
CCTCC NO:C2023102
，保藏地址：中国武汉
。
[0010]本专利技术还提供了一种重组蛋白，其为表达所述
ST
‑
Beclin1
‑
GFP
细胞系或所述的猪睾丸细胞
ST
‑
Beclein1
中的
Beclin1
基因产生的蛋白
。
[0011]本专利技术还提供了所述的
ST
‑
Beclin1
‑
GFP
细胞系或所述的猪睾丸细胞
ST
‑
Beclein1
在制备猪瘟病毒疫苗和
/
或猪瘟弱毒疫苗中的应用
。
[0012]其中，所述病毒包括猪瘟病毒或猪瘟弱毒中的一种或两种
。
[0013]本专利技术还提供了所述的
ST
‑
Beclin1
‑
GFP
细胞系或所述的猪睾丸细胞
ST
‑
Beclein1
在研究
Beclin1
促进病毒复制的方式和
/
或分离和培养病毒中的应用
。
[0014]其中，所述病毒包括猪瘟病毒或猪瘟弱毒中的一种或两种
。
[0015]有益效果：与现有技术相比，本专利技术具有如下显著优点：
[0016]1、
本专利技术利用
G418
抗生素筛选的方法构建了
Beclin1
基因稳定表达的
ST
细胞系
ST
‑
Beclin1
‑
GFP
，经改造后该细胞系稳定，细胞形态
、
增殖速度等方面均与对照细胞无明显差异，是较为理想的
Beclin1
过表达细胞模型，为探究
B本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种构建重组质粒
Beclin1
‑
GFP
的方法，其特征在于，包括以下步骤：
PCR
扩增
Beclin1
基因，酶切，克隆至
pEGFP
‑
C1
载体上，获得重组质粒
Beclin1
‑
GFP
；所述
PCR
扩增
Beclin1
基因中的引物组合如
SEQ ID NO.1
～4所示
。2.
一种由权利要求1所述方法构建的重组质粒
Beclin1
‑
GFP。3.
一种构建
ST
‑
Beclin1
‑
GFP
细胞系的方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求2所述的重组质粒
Beclin1
‑
GFP
转染至猪肾细胞系，即获得
ST
‑
Beclin1
‑
GFP
细胞系
。4.
一种由权利要求3所述的方法构建得到的
ST
‑
Beclin1
‑
GFP
细胞系
。5.
一种猪睾丸细胞
ST
‑
Beclein1
，其特征在于，其保藏于中国典型培养物保藏中心
(CCTCC)
，保藏日期为
2023
年4月
25<...

【专利技术属性】
技术研发人员：张成成，孙嘉豪，李薇，薄宗义，郭梦娇，张小荣，吴艳涛，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：